[发明专利]一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。本发明首次利用启动子优化后的新型CRISPR/Cas9系统构建二萜类新骨架化合物生物合成基因被敲除的重组拟盾壳霉FS482菌株，建立了一种高效的适用于深海真菌拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除体系，从而为拟盾壳霉FS482新型活性次级代谢产物的生物合成机制的阐明以及获得更多具有显著生物学活性的新型次级代谢产物奠定分子生物学基础。

技术领域

本发明属于生物化学和分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

背景技术

深海真菌Paraconiothyrium hawaiiense FS482是一种来源于深海的拟盾壳霉，该真菌能产生具有抑制血管紧张素转化酶的新骨架二萜类化合物，因此具有发掘抗高血压类药物先导化合物的潜力。在此基础上，对P. hawaiiense FS482进行了基因组测序，预测了新骨架化合物的生物合成基因簇。预测该化合物由含有萜类环化酶、P450单加氧酶和甲基转移酶的cluster 66生物合成，P450单加氧酶对其骨架的形成及修饰都发挥重要功能。因此有必要对P450进行缺失以验证其在二萜类新骨架化合物生物合成过程中的功能。但是目前深海真菌P. hawaiiense FS482基因敲除体系尚未成功建立，限制了其活性次级代谢产物生物合成机制解析。因此，本发明将首次建立深海真菌P. hawaiiense FS482的基因敲除体系，从而为活性次级代谢产物生物合成机制的解析及通过合成生物学策略获得得更多新型衍生物奠定基础。

CRISPR/Cas9是一种由sgRNA介导Cas9核酸酶对靶向基因进行切割的基因编辑技术。通过对Cas9的突变及融合可使CRISPR/Cas9系统广泛应用于目的基因的转录激活、甲基化修饰和单碱基突变等。CRISPR/Cas9系统由于构建简单、基因敲除效率相对较高、可控性强、成本较低等优点已经在哺乳动物细胞、干细胞、酵母、细菌的基因组编辑方面有着十分广泛的应用，而由于深海真菌独特生境导致的相对复杂的遗传背景，且CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中敲除效率相对较低。

发明内容

本发明的目的在于克服目前深海真菌缺乏有效的遗传操作手段的现状，提供一种适用于拟盾壳霉FS482（Paraconiothyrium hawaiiense FS482）的CRISPR/Cas9载体及其构建方法和应用。

本发明首次将优化后的CRISPR/Cas9系统应用于深海真菌拟盾壳霉目的基因的敲除。

本发明的第一个目的是提供一种适用于丝状真菌的CRISPR/Cas9基因敲除载体，其是通过以下步骤制备得到的：

a. 采用限制性内切酶PacI 对pFC332载体进行酶切，对酶切后的pFC332载体进行回收；

b. 以pG-F: CATCTAGAGGGCCGCTTAATGAGGACCGCTCGTCCCCTAT和PG-R: CTAGTAATGCGTAGAGGTGCGTCTGCCATGGTGATGGGAC为引物，以埃德菌FS110基因组DNA为模板，扩增并回收得到pG启动子片段；

c. 将pG启动子片段采用同源重组插入至酶切后的pFC332载体，菌液PCR和测序验证pG启动子的插入，构建得到pG-pFC332载体。

通过上述的构建方法，将pFC332载体中的原启动子替换为转录活性更强的pG启动子。

优选，所述的丝状真菌为拟盾壳霉FS482。

本发明还提供一种适用于拟盾壳霉FS482的CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：