[发明专利]一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法，一种茄子原生质体制备方法，所述方法至少包括以下步骤：1)将去除下表皮的茄子叶片置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；将步骤1)中的所述酶解混合液进行酶解终止，再进行过滤和纯化，获得茄子原生质体。一种茄子原生质体瞬时转化方法，所述转化方法至少包括：将茄子原生质体制备的混悬液与质粒液混合，再加入PEG‑Ca²⁺溶液进行混合后静置转化，终止转化，经离心获得转化后的原生质体。本发明提供的方法能够通过快速的酶解反应获得大量的原生质体，提高了茄子原生质体的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)种质资源丰富，类型多样，在世界各地均有种植。茄子中含有丰富的维生素、矿物质、蛋白质、糖类和重要的植物营养素，如酚类化合物和氟类化合物，具有良好的抗氧化活性。随着生活水平的不断提高，人们对茄子的品质提出了新的要求，选育茄子新品种尤为重要。目前，茄子已经完成基因组测序，这对科研人员及育种工作者有着重要的参考价值和实践意义，使基因组研究从结构基因组学逐渐转向了基因功能分析。

瞬时表达技术指的是在短时间内将目标基因转入到受体细胞，在受体细胞内建立起高效的表达系统，获得该目标基因短暂而高水平表达的技术。相较于稳定基因表达技术，瞬时表达技术在转化过程中，外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，并未与受体基因组染色体相整合，为基因－蛋白质研究提供了一种快速、方便的方法，并且对稳定遗传进行基因功能鉴定给予了重要的参考意义。

原生质体是一种良好的瞬时表达媒介，具有高效、快速、稳定的特点，为细胞水平基因功能的验证提供了便利。茄子原生质体的提取早在1981年就已完成，并采用原生质体培养技术成功得到再生植株。其后又出现了大量关于茄子种属间体细胞杂交的报道，原生质体融合技术逐渐成熟。然而，目前茄子原生质体的应用仍停留在细胞水平，且获取的原生质体产量较低。近年来，大量植物建立了原生质体瞬时表达系统，而基于茄子原生质体的瞬时表达技术还很少见，时至今日也没有正式的报道。

因此，本领域的技术人员致力于探索并建立一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法，建立适用于茄子的原生质体分离及转化体系，为茄子基因功能的研究提供良好的技术平台。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种茄子原生质体的制备及瞬时转化方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种茄子原生质体的制备方法，包括以下步骤：

1)将去除下表皮的茄子叶片置入酶解液中进行酶解，获得酶解混合液；

2)将步骤1)中的所述酶解混合液进行酶解终止，再进行过滤和纯化，获得茄子原生质体。

本发明第二方面提供一种应用于第一方面的酶解液，所述酶解液包括以下重量份百分比或浓度的组分：1.25％(w/v)纤维素酶R-10，0.4％(w/v)离析酶R-10，0.5mol/L甘露醇，10mmol/L氯化钙，20mmol/L 2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，20mmol/L氯化钾，1.5mmol氯化镁，1.5mmo/L磷酸二氢钾。

本发明第三方面提供一种茄子原生质体，所述原生质体由第一方面所述的茄子原生质体制备方法制得。

本发明第四方面提供一种茄子原生质体瞬时转化方法，所述转化方法包括以下步骤：将第三方面所述的茄子原生质体制备的混悬液和质粒液混合，再加入PEG-Ca²⁺溶液进行混合后静置转化，终止转化，经离心获得转化原生质体。

根据本发明第五方面提供一种转化茄子原生质体，所述转化茄子原生质体由第四方面所述的茄子原生质体瞬时转化方法制得。