[发明专利]一种具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株及其应用在审
| 申请号： | 202011458293.X | 申请日： | 2020-12-10 |
| 公开（公告）号： | CN114621882A | 公开（公告）日： | 2022-06-14 |
| 发明（设计）人： | 周雍进;段兴鹏 | 申请（专利权）人： | 中国科学院大连化学物理研究所 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N15/81;C12N15/65;C12R1/84 |
| 代理公司： | 北京元周律知识产权代理有限公司 11540 | 代理人： | 张梅娟 |
| 地址： | 116023 *** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 具有 同源 重组 效率 酵母 菌株 及其 应用 | ||
1.一种具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株包括毕赤酵母基因和过表达PpRAD52基因。
2.根据权利要求1所述的具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述过表达PpRAD52基因整合在毕赤酵母AOX1位点或HIS4基因位点。
3.根据权利要求2所述的具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述过表达PpRAD52基因以单交换的方式整合到毕赤酵母AOX1位点；
或者所述过表达PpRAD52基因以同源重组方式整合到毕赤酵母HIS4基因位点。
4.根据权利要求1所述的具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株敲除了毕赤酵母非同源末端连接关键蛋白KU70/KU80基因中的至少一个；
或者抑制了非同源末端连接关键蛋白KU70/KU80基因中至少一个的表达强度。
5.根据权利要求4所述的具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述抑制非同源末端连接关键蛋白KU70/KU80基因表达强度，通过将所述KU70/KU80基因的启动子替换为抑制型启动子实现；
优选地，所述抑制型启动子为毕赤酵母自身来源的MET3基因的启动子PMET3。
6.一种毕赤酵母代谢工程改造方法，其特征在于，所述方法至少包括：
采用CRISPR/Cas9系统，对毕赤酵母菌株的基因序列进行无缝敲除或/和多片段体内定点重组；
所述毕赤酵母菌株为权利要求1-5任一项所述的具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的毕赤酵母代谢工程改造方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统的表达载体中包括筛选标记；
所述筛选标记为来Zeocin抗性基因和Geneticin抗性基因中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的毕赤酵母代谢工程改造方法，其特征在于，所述无缝敲除的同源臂长度为50～1000bp，且位于敲除基因启动子或终止子区域。
9.根据权利要求8所述的毕赤酵母代谢工程改造方法，其特征在于，所述敲除基因为毕赤酵母菌株的PpSGS1、PpTOP3、PpRMI1或PpMPH1基因。
10.根据权利要求6所述的毕赤酵母代谢工程改造方法，其特征在于，所述多片段体内定点重组的片段整合长度为11013bp，片段数量为3段，且重叠区为重组基因的启动子或终止子区域；
优选地，所述重组基因为过表达PpMUS81-PpMMS4基因或PpSLX1-PpSLX4基因。
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