[发明专利]一种具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株及其应用

说明书

本发明公开了一种用于毕赤酵母同源重组的菌株及其应用，菌株包括毕赤酵母基因和过表达PpRAD52基因。本发明通过在现有毕赤酵母基因与过表达PpRAD52基因的整合、敲除KU70/KU80基因或抑制KU70/KU80基因表达强度，提高了毕赤酵母的同源重组效率。本发明用于毕赤酵母同源重组的菌株具有高同源整合能力，并且证实了通过表达同源重组相关蛋白以及下调非同源末端连接强度均可以改善毕赤酵母同源重组活力。

技术领域

本发明属于微生物基因工程应用技术领域，具体涉及一种具有高同源重组效率的毕赤酵母菌株及其应用。

背景技术

微生物生长迅速、反应条件温和及易于控制，但是微生物细胞工厂所需碳源多以生物质来源的葡萄糖和蔗糖为底物，消耗量大使得成本高。作为全球流通的重要原料，甲醇主要原料来源为煤炭，煤炭直接燃烧能量值低且会造成严重污染，利用劣质煤炭转化的甲醇为原料构建微生物细胞工厂合成脂肪酸类衍生物可推进煤炭资源的洁净利用，并为可再生石油化工产品的生产提供了一种新途径。传统的模式微生物无法以甲醇作为唯一碳源使得甲醇利用效率低。甲醇自养酵母如毕赤巴斯德酵母(Komagataella phaffii)因其生长快、可进行高密度发酵及能够适应苛刻的工业化条件等优势成为理想的甲醇转化宿主。

毕赤酵母作为外源基因表达的宿主，目前被证明可表达5000多种蛋白质。但主要依靠单交换的方式将需要表达的蛋白整合在AOX1启动子、GAP启动子等较少的位点，难以实现基因的定点敲除和外源基因的高效定点整合进而只能进行种类较少的蛋白表达，在毕赤酵母中很难实现多基因代谢途径的整合。

近年来，CRISPR/Cas9技术的兴起使得基因编辑效率显著提升，该技术已经广泛应用于真核、原核、模式以及非模式等众多生物体系基因的定点编辑和基因整合。CRISPR/Cas9可以很容易地在几乎任何需要的基因组位点上引入目标链断裂，进行重新编程。CRISPR/Cas9技术实现基因编辑，主要依靠Cas9蛋白借助短导向RNA(gRNA或者单导向gRNA，sgRNA)在基因组中与gRNA的互补区域诱导一个双链断裂(Double Strand Break，DSB)。随后依靠细胞内的内源修复机制对DSB进行修复。因此在有Cas9蛋白存在的条件下，通过更换gRNA的20bp序列可对不同的靶标位点进行编辑。Weninger等对毕赤酵母的CRISPR/Cas9系统进行了构建，使用人源密码子优化的Cas9和还有核糖酶侧翼的gRNA，同时使用毕赤酵母自身来源的双向、组成型RNA聚合酶II型启动子对Cas9和gRNA进行表达。并利用核酸酶去除gRNA两端多余的5’/3’序列，实现了对毕赤酵母基因的有效编辑(A.Weninger,A.M.Hatzl,C.Schmid,T.Vogl,A.Glieder,Combinatorial optimization of CRISPR/Cas9expression enables precision genome engineering in the methylotrophic yeastPichia pastoris.J Biotechnol 235,139-149(2016).)。然而与高同源重组效率的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不同，毕赤酵母等非传统酵母在进行基因组修复时同源重组的效率很低，主要依靠非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)的方式进行修复，依靠毕赤酵母自身的同源重组过程在进行基因的无缝敲除和外源基因的定点整合方面存在很大难度。非同源末端链接修复的DNA会使基因编码序列产生短的碱基序列插入或缺失导致基因移码突变失活，该机制随机性较高，很难实现特定目的基因敲除和整合。同源重组能够依赖供体DNA同源臂，实现特定基因的定点敲除和基因整合。然而，生物系统是否进行同源重组修复，主要依赖生物系统自身的特性，而不依赖CRISPR/Cas9系统。因此增强生物系统自身的同源重组修复能力成为完善该物种基因编辑平台的重要组成部分。虽然在此前已有报道通过敲除NHEJ相关的重要基因KU70以及将自主复制序列(Autonomouslyreplicating sequence，ARS)连接到供体序列的方式显著提高了毕赤酵母同源重组效率。但对于通过加强毕赤酵母自身同源重组系统相关基因有效提高同源重组效率的研究还未有报道。主要原因是毕赤酵母为非传统酵母，其基因组虽然已经测序，但其中的大部分基因功能尚未被证实。其次未能找到毕赤酵母同源重组系统中导致同源重组系统效率低的关键限速环节的关键基因。