[发明专利]一种真菌绝对定量的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种真菌绝对定量的试剂盒及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。本发明的真菌微生物定量探针和试剂盒，能够实现所有真菌微生物的总量检测，用于检测和真菌微生物定量时不需要使用昂贵仪器，可在2.5h内快速完成定量工作。同时，本发明所使用的样品不必须进行核酸提取。基于本发明的探针、检测试剂盒用于真菌微生物定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。

技术领域

本发明涉及一种真菌绝对定量的试剂盒及其应用，属于生物领域、发酵领域、检测领域。

背景技术

传统发酵食品酿造过程中有复杂的微生物菌群参与，其中真菌是重要的功能微生物。这些微生物与最终产品的品质密切相关，在发酵过程中，真菌微生物参与一系列的底物降解和产物合成相关的生理生化反应，将原料中的可利用糖原，蛋白质等大分子转化为醇类，醛类，酸类，酯类等风味成分，赋予产品独特的风味和感官特征。因此，实时跟踪发酵过程中真菌微生物的生长变化趋势对发酵过程控制，酿造工艺优化具有重要的指导意义。

目前，许多方法被用来对微生物进行绝对定量，例如以磷酸脂肪酸检测(PLFA)，ATP检测，生物量碳检测(MBC)为代表的基于生物物质标记的检测方法；以高通量测序，共聚焦显微镜，流式细胞术，荧光定量PCR为代表的基于生物基因标记的定量方法。但目前的检测方法均存在不足：基于生物物质标记的检测方法在物种分辨率较低，不能区分微生物的种类，只能测定所有微生物的总量。基于生物基因标记的定量方法一般具有较高的检测限(如荧光定量PCR的检测限可达10个微生物以内)，但需要高额的仪器设备和严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测。

G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。

目前，基于G四链体/血红素模拟酶活检测的原理有被用于微生物的特异性检测的报道；例如文献Wang Y,Li X,Xi D,Wang X.Visual detection of Fusariumproliferatum based on asymmetric recombinase polymerase amplification andhemin/G-quadruplex DNAzyme.Rsc Advances 2019；9:37144-37147.中，使用了不对称特异性引物(上游引物添加G四链体的反向序列修饰，下游不修饰)，该方法只能适用于样本中特定细菌Fusarium proliferatum的检测，无法实现所有真菌微生物的总量检测；此外，该文献利用该不对称特异性引物进行检测时，是在PCR体系中添加不同浓度的上下游引物(上游引物浓度低，下游引物浓度高)，通过重组聚合酶扩增(RPA)扩增形成双链产物，随着PCR反应的进行，上游引物被消耗殆尽，下游引物使用新合成的双链DNA为模板扩增，从而形成带有G四链体末端的单链DNA，从而使用G四链体/血红素模拟酶活检测检测样本中的Fusarium proliferatum。但该定量方法依然需要PCR步骤产生G四链体，而PCR过程依然需要高额PCR设备以及严格的操作环境。

发明内容

本发明的一种用于真菌微生物绝对定量的方法、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)现有的方法无法实现所有真菌微生物的总量检测；(2)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(3)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(4)现有定量方法操作繁琐等。

本发明的第一个目的是提供一组探针，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQ ID NO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)。