[发明专利]CK20抗原、杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用

说明书

本发明涉及CK20抗原、杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用。本发明结合细胞角蛋白序列特点，选取CK20高变的头部和尾部序列，中间采用连接元件连接，按照头部‑连接元件‑尾部的顺序进行基因合成，插入到原核表达载体，表达纯化获得CK20抗原；并以此作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆细胞，间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，最终获得能稳定分泌鼠抗人CK20单克隆抗体的杂交瘤细胞株C7C11，保藏编号为CCTCC NO：C2020201；通过动物体内诱生制备单抗，并别通过Western Blot和免疫组化(IHC)验证该单抗的特异性和灵敏度。本发明提供的CK20单克隆抗体具有更好的特异性和灵敏度，可以用于制备CK20体外免疫检测试剂或试剂盒。

技术领域

本发明涉CK20抗原、杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用，属于免疫学技术领域。

背景技术

细胞角蛋白属于中间纤维的一种成分，中间纤维蛋白由中部大约310个氨基酸组成的杆状区，两端是高变的N端头部和C端尾部组成。由于中间纤维的特有组成，形成了其特有的结构：非螺旋的头部-螺旋的杆部-非螺旋的尾部，杆部氨基酸序列具备较高的同源性，同一类型中间纤维杆部有70％-90％的同源性，然而细胞角蛋白作为中间纤维的一种重要组成，目前已经发现54个成员，因此在进行免疫学实验时易出现因同源性而造成低特异性，特异性识别某种细胞角蛋白显得尤为重要。

细胞角蛋白20(CK20)作为细胞角蛋白的一个重要组成，由424个氨基酸组成，其相对分子量为48000。在正常组织中，CK20在肠黏膜细胞、胃黏膜细胞、幽门腺体细胞、十二指肠黏膜细胞、泌尿伞状细胞、Merkel细胞中表达。在肿瘤组织中，CK20常表达于结直肠癌、胆管腺癌、胰腺导管腺癌、粘液性卵巢肿瘤、Merkel细胞肿瘤和移行细胞癌。据报道，在肿瘤中，CK20在不同癌中的表达有显著差异。而表达CK20的肿瘤细胞来源于自身表达CK20的正常上皮细胞。因此，CK20常用来鉴别肿瘤的组织来源。

CK20常用的体外免疫检测方法为免疫组织化学(IHC)法，在IHC法检测离体组织细胞中CK20表达情况过程中起到关键作用的是抗人CK20单克隆抗体，其特异性结合人CK20蛋白的能力决定了检测方法的灵敏度和特异性。现有CK20体外免疫检测抗体多依赖进口，种类较少、灵敏度有待提高且价格昂贵。目前制备的CK20单克隆抗体多采用天然提取、原核表达CK20全长重组蛋白或者人工合成多肽进行免疫。但是由于中间纤维杆部氨基酸序列具备较高的同源性，以CK20全长重组蛋白作为免疫原制备抗体时易出现因同源性而造成低特异性问题，导致单克隆细胞株筛选难道增加。在诊断试剂开发中用全长型CK20蛋白制备抗体，容易获得可以识别多种细胞角蛋白的低特异性抗体，导致开发的失败。此外，使用合成多肽做免疫原可以确定抗体识别表位，但不同位置的多肽片段在蛋白三维结构和不同分子间相互作用的不同，可能会对结果带来差异从而影响判断和诊断。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种CK20抗原，是在人CK20蛋白头部与尾部片段之间加入连接元件获得的融合蛋白，能够用于免疫动物获得CK20抗体。

其次，本发明提供了由上述抗原作为免疫原制备获得的鼠抗人CK20单克隆抗体。

同时，本发明提供了能够稳定分泌鼠抗人CK20单克隆抗体的杂交瘤细胞株及利用该杂交瘤细胞株制备CK20单克隆抗体的方法。

再次，本发明提供了上述鼠抗人CK20单克隆抗体在制备CK20体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。

最后，本发明提供了一种CK20免疫组化检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种CK20抗原，是在人CK20蛋白头部与尾部片段之间加入连接元件获得的融合蛋白，具体由以下结构组成：