[发明专利]一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，特征在于：包括重组表达质粒、重组蛋白的表达和蛋白的纯化；重组表达质粒时，所用质粒为pET-20b（+）质粒，将紫花苜蓿植物铁蛋白基因序列克隆至pET-20b（+）质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间，得含目的基因的重组质粒；

紫花苜蓿植物铁蛋白的编码基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

重组蛋白的表达为，在42±2℃的条件下，将重组质粒热激转化至大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)中，从平板上挑取单菌落于TB培养基中扩大培养至OD600=1.8，经IPTG诱导后，离心收集菌体沉淀，再将菌体沉淀用缓冲液重悬、超声破碎、离心后，得到的上清液即为紫花苜蓿植物铁蛋白的粗产品，其中，重悬所用缓冲液pH=8，组成为：20mM Tris，500mM NaCl，0.5% Triton X-100和2mM DTT；

蛋白的纯化时，采用镍柱亲和层析对目的蛋白进行纯化，包括如下步骤：

A、将预装镍柱用10±1倍柱体积的无菌水清洗两次，再用10±1倍柱体积的结合缓冲液平衡镍柱；

B、将蛋白粗品过0.45μm滤膜后，与Ni-NTA树脂结合，置于旋转培养器中，在4±1℃环境中孵育55~65min，使目的蛋白与镍柱充分结合；

C、用pH=6.3的5±0.1mM咪唑洗除杂蛋白，接着用洗脱液洗脱目的蛋白，再用体积排阻色谱纯化，得到纯紫花苜蓿重组植物铁蛋白。

2.如权利要求1所述的紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，特征在于：扩大培养于含氨苄青霉素的TB培养基中培养，其中，菌液按照1%的比例接种于TB培养基中，扩大培养时的温度为37±2℃，转速为210±10r/min。

3.如权利要求1或2所述的紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，特征在于：IPTG的诱导终浓度为1±0.02mM，诱导温度为25±2℃，转速为200±10r/min，诱导终时间为16±1h。

4.如权利要求1或2所述的紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，特征在于：超声破碎的条件为：在功率为960W的条件下，每超5±1s，停5±1s，总时长为30±2min；超声破碎后的离心条件为：8000×ｇ，离心30min。

5.权利要求1-4任意一项所述的紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法所得紫花苜蓿重组植物蛋白的应用，其特征在于：用于柚皮素的装载。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：柚皮素装载的方法，包括如下步骤：

A、将柚皮素溶于无水乙醇制备成母液；

B、所得的紫花苜蓿重组植物蛋白中添加尿素避光孵育2±0.3h，得蛋白溶液；

C、步骤A的母液加入到步骤B所得的蛋白溶液中，4±1℃条件下避光搅拌30±5min，然后将溶液转移至透析袋中，透析除去尿素和未结合的柚皮素分子，离心后，得到的澄清透明溶液为紫花苜蓿重组植物蛋白-柚皮素复合物。