[发明专利]一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用

说明书

本发明公开了一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用。紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，包括重组表达质粒、重组蛋白的表达和蛋白的纯化；重组表达质粒时，所用质粒为pET‑20b(+)，将紫花苜蓿植物铁蛋白基因序列克隆至pET‑20b(+)质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间，得含目的基因的重组质粒。本发明紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，得到的紫花苜蓿植物铁蛋白呈球形笼状结构，分子量约为28kDa，直径约为12±0.5nm，水溶性好、热力学稳定性高，分散均一。作为一种新型的植物铁蛋白，为生物活性物水溶性、稳定性和生物利用度等的提高，提供了一种新型纳米载体，在食品、医疗、保健等方面有良好的应用前景，具有很高的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法及其应用，属于植物铁蛋白技术领域。

背景技术

铁蛋白在生物体内具有维持体内铁的代谢平衡、清除铁介导的自由基反应、以及保护细胞免受氧化性损伤的作用。铁蛋白广泛存在于动物、植物和微生物中，每个铁蛋白内部最多可储存约4500个铁原子。铁蛋白通常由24个亚基自组装形成高度对称的笼状结构，内径和外径分别为8nm和12nm，厚度约为2nm。每分子的铁蛋白可以形成12个二重轴通道，8个三重轴通道，4个六重轴通道，这些通道控制着离子或小分子进出铁蛋白，联系内部空腔与外部环境。

动物铁蛋白纳米载体在癌症治疗、免疫检测、医学成像领域已取得了突破性进展。然而，目前对植物铁蛋白的研究尚未深入，植物铁蛋白分布广泛，主要存在质体中，与动物铁蛋白具有相同的起源，但植物铁蛋白的24个亚基均为H型，每个亚基都含有一个亚铁氧化中心，其中的H-1和H-2型亚基具有80％的氨基酸序列同源性。成熟植物铁蛋白的 N端有一段由约30个氨基酸组成的延伸肽，参与铁的氧化沉淀，诱导蛋白质的聚合，提高蛋白质的稳定性。若能将植物铁蛋白表达纯化，则具有广阔的应用前景，然而由于不同植物铁蛋白个体性能上的差异，导致表达纯化的条件上存在根本性差异。

发明内容

本发明提供一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，紫花苜蓿植物铁蛋白呈球形笼状结构，水溶性好，热稳定好，是一种可用于生物活性物质及药物递送的新型纳米载体。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种紫花苜蓿植物铁蛋白的表达纯化方法，包括重组表达质粒、重组蛋白的表达和蛋白的纯化；重组表达质粒时，所用质粒为pET-20b(+)质粒，将紫花苜蓿植物铁蛋白基因序列克隆至pET-20b(+)质粒的NdeI和XhoI酶切位点之间，得含目的基因的重组质粒。

紫花苜蓿植物铁蛋白来源于紫花苜蓿。

紫花苜蓿植物铁蛋白的编码基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；紫花苜蓿植物铁蛋白的编码蛋白为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

为了提高产品的得率和效率，重组蛋白的表达为，在42±2℃的条件下，将重组质粒热激转化至大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)中，从平板上挑取单菌落于TB培养基中扩大培养OD600＝1.8，经IPTG诱导后，离心收集菌体沉淀，再将菌体沉淀用缓冲液重悬、超声破碎、离心后，得到的上清液即为紫花苜蓿植物铁蛋白的粗产品，其中，重悬所用缓冲液 pH＝8，组成为：20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，500mM NaCl，0.5％Triton X-100(聚乙二醇辛苯基醚)，2mM DTT(二硫苏糖醇)。

本申请％，没有特别说明的情况下，指体积百分比。

为了提高产品的得率，扩大培养于含氨苄青霉素的TB培养基中培养，其中，菌液按照1％的比例接种于TB培养基中，扩大培养时的温度为37±2℃，转速为210±10r/min。

优选，IPTG的诱导终浓度为1±0.02mM，诱导温度为25±2℃，转速为200±10r/min，诱导终时间为16±1h。当诱导温度更换为30℃，诱导终浓度为5mM时，表达出的蛋白为包涵体，不可溶。