[发明专利]一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组、杂交瘤细胞组及胶乳增强免疫比浊法试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测β淀粉样蛋白的基因序列组和杂交瘤细胞组，以及基于它们的β淀粉样蛋白的胶乳增强免疫比浊法试剂盒。本发明自制了三株单克隆抗体，交联到胶乳微球上，形成胶乳增强免疫比浊法试剂盒，相比酶联免疫法，该方法测定β淀粉样蛋白，可在全自动生化分析仪上使用，成本低廉且自动化高节省检测时间。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域及免疫学测定分析领域，具体涉及一种基于单克隆抗体制备的β淀粉样蛋白胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒(A amyloidβ-protein latexenhanced turbidimetric test kit based on monoclonal antibodies)及其制备方法。

背景技术

抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体，通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein，Aβ)分子量约4kDa，由淀粉样前体蛋白水解而来，由细胞分泌，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。它是一种主要含有40个或42个氨基酸的多肽，是由前体蛋白APP经过两次蛋白酶切而来。且在三维结构中呈β折叠，故称为“β淀粉样蛋白”。

β-淀粉样蛋白可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在，由淀粉样前体蛋白水解产生。淀粉样前体蛋白可能被三种分泌酶酶切，而只有同时经过β分泌酶和γ分泌酶的酶切才可得到Aβ。α分泌酶则扮演着阻止Aβ分泌的角色，平衡Aβ的分泌水平。含有40个氨基酸的Aβ1-40是体内最常见的，而含有42个氨基酸的Aβ1-42则被发现在AD中分泌增加且更容易发生淀粉样聚集，这可能与Aβ1-42C末端增加的两个疏水性氨基酸有关。在健康人的一生中，Aβ都会存在于大脑和脑脊液中，所以，Aβ的存在并不意味着神经病变。当出现神经元损伤时，生理分泌的可溶性Aβ聚集为低聚物或更大的Aβ纤维，则被认为是AD发病的一个决定性因素。然而，通常以可溶形式存在于脑脊液和血浆中的Aβ为何变得容易聚集并形成具有神经毒性的低聚物、原纤维和成熟的纤维，进而累积形成斑块，造成这种现象的原因还不是特别清楚。Shaked等提出，Aβ可以直接与APP相互作用，促进APP的聚集，经过一系列的级联反应，最终会引起细胞凋亡；而作用的位点正是APP上的Aβ区域。崔玉琴等人也对AD患者血清中β淀粉样蛋白的含量及临床意义进行了研究。他们采用放射免疫分析法检测了22例AD患者和30例正常对照组血清中Aβ的含量。结果显示，AD患者血清中Aβ的含量明显高于对照组，以72.3pg/mL作为正常人群Aβ的上限，诊断老年性痴呆的敏感性为63.6％，特异性为83.3％；最终实验的结论为AD患者血清中Aβ含量升高，对诊断老年性痴呆有较高的敏感性和特异性，具有一定临床应用价值。彭丹涛在其论文中也研究了老年性痴呆患者血浆中Aβ1-40，Aβ1-42及P-Tau的产生及变化。采用Sigma公司生产的Aβ1-40，Aβ1-42试剂盒对早期AD患者、中期AD患者及非痴呆对照组的人群进行研究，最终发现，AD早期患者Aβ1-40和Aβ1-42血浆浓度均有升高，其中Aβ1-42浓度显著升高，Aβ1-40浓度较对照组仅有上升趋势，并无统计学意义。而中期与对照组相比Aβ1-42浓度差异无显著性，这可能是由于随着病情的加重，Aβ1-42沉淀加速致使其血浆浓度下降。故Aβ1-42血浆浓度升高有可能成为很好的AD早期诊断的辅助指标，但还需进一步加大样本量进行验证。

目前，市售的β淀粉样蛋白(Aβ)检测试剂盒主要是采用酶联免疫技术，该方法存在灵敏度低、线性范围窄、操作步骤复杂、耗时等问题，且无法满足临床应用要求。因此，目前尚需一种污染小、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低的Β淀粉样蛋白(Aβ)的快速定量检测方法。

发明内容