[发明专利]单增李斯特菌和细菌总数快速同步多重检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种非诊断目的的快速同步多重检测样品中单增李斯特菌和细菌总数的方法，其特征如下：

1）区分样品中的细菌和其它背景颗粒：使用可以标记全部细菌的红色荧光探针对细菌总数进行标记；

2）区分样品中的单增李斯特菌和非单增李斯特菌：使用绿色荧光探针通过化学基团交联的单增李斯特菌抗体，特异性标记样品中的单增李斯特菌；

3）通过流式分析仪同时计数1）和2）产生的红色和绿色荧光信号，实现单增李斯特菌和细菌总数的同步定量检测；

上述2）中，制备所述抗体的免疫原，为4个血清型单增李斯特菌菌株的特异性膜蛋白的混合物，所述4个血清型分别为1/2a、1/2b、1/2c和4b；且，将制备得到的抗体进行筛选，选出符合以下 a-d技术指标的抗体，即为可同步检测单增李斯特菌和细菌总数的抗体:

a 所述抗体可以在流动相内与单增李斯特菌发生反应；

b 所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对单增李斯特菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；

c 所述抗体与单增李斯特菌特异性菌体蛋白的亲和力KD应小于1 ×10-9；

d 所述抗体能够识别血清型为1/2a、1/2b、1/2c和4b的单增李斯特菌菌株;

上述3）中，单增李斯特菌和细菌总数的判定方法如下：对于一个颗粒产生的事件，如果仅检测到红色荧光，则判定为细菌，但不是单增李斯特菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定为单增李斯特菌；如果未检测到荧光，则判定为非细菌的杂质颗粒。

2.权利要求1所述的方法，所述通过流式分析仪计数，是通过流式分析仪的散射光通道进行圈门，权利要求1并通过双荧光通道检测所述红色和绿色荧光信号，从而计数单增李斯特菌和细菌总数；其中，前向角散射光通道的圈门在500 nm到2500 nm之间。

3.权利要求2所述的方法，所述圈门，其方法为：使用流式分析仪测量500 nm标准微球和2500 nm标准微球，在前向角散射光通道的直方图上，根据微球的信号位置进行圈门，下限在500 nm，上限在2500 nm。

4.权利要求1所述的方法，所述红色荧光探针的荧光发射光谱在 601 nm～640 nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在 501 nm～540 nm。

5.权利要求1所述的方法，所述流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度10MESF，散射光灵敏度50 nm，荧光分辨率RSD 3%，散射光分辨率 3 %；分析速度为1～30μL/min，检测时间为 15～300 s。

6.权利要求1~5任一所述的方法，待检样品进行检测之前需要进行纯化处理；所述纯化，方法是将待测样品加入水中悬液，然后过滤收集滤液，将滤液离心并弃去上层液体，保留底部的沉淀，然后加入PBS重悬，得到纯化的样品菌悬液。

7.一种用于快速同步多重检测样品中单增李斯特菌和细菌总数的单增李斯特菌抗体，技术指标如下：

a 制备所述抗体所用免疫原为4个血清型单增李斯特菌菌株的特异性膜蛋白的混合物，所述4个血清型分别为1/2a、1/2b、1/2c和4b；

b 所述抗体可以在流动相内与单增李斯特菌发生反应；

c 所述抗体经过绿色荧光探针交联后，能够对单增李斯特菌进行荧光标记，且荧光可以被荧光显微镜和流式分析仪观察到；

d 所述抗体与单增李斯特菌特异性菌体蛋白的亲和力KD应小于1 ×10-9；

e 所述抗体能够识别血清型为1/2a、1/2b、1/2c和4b的单增李斯特菌菌株。

8.一种快速同步多重检测样品中单增李斯特菌和细菌总数的试剂盒，其特征是具有：

可以标记样品中全部细菌的红色荧光探针；

绿色荧光探针通过化学基团交联的特异性单增李斯特菌抗体；

500 nm和2500 nm的校准微球；

所述单增李斯特菌抗体如权利要求7所述。

9.权利要求8所述的试剂盒，还含有孔径2.5 μm～15 μm的滤膜；且所述红色荧光探针的荧光发射光谱在 601 nm～640 nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在 501 nm～540nm。