[发明专利]单增李斯特菌和细菌总数快速同步多重检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种快速同步多重检测样品中单增李斯特菌和细菌总数的方法和检测试剂盒。使用可以标记全部细菌的红色荧光探针对细菌总数进行标记，区分样品中的细菌和其它背景颗粒：同时，使用绿色荧光探针通过化学基团交联的单增李斯特菌抗体，区分样品中的单增李斯特菌和非单增李斯特菌；通过流式分析仪同时计数红色和绿色荧光信号，实现单增李斯特菌和细菌总数的同步检测。本方法能够同时检测单增李斯特菌和细菌总数，操作简单便捷，耗时短，大多数样品均可在0.5h内完成检测。

技术领域：

本发明属于食品微生物检测领域，特别涉及在食品样品中单增李斯特菌和细菌总数两项指标的快速同步多重检测及试剂盒。

背景技术：

单增李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，能引起人畜的李氏菌病。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。菌落总数通常指细菌总数，用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，其在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。

传统的培养法对单增李斯特菌的测量方法费时费力，如国标GB 4789.30-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特菌检验》，该方法需要预增菌、增菌，培养，生化鉴定等一系列步骤，花费时间在72小时以上。

细菌总数的平板计数法也有很多缺点，如国标GB 4789.2-2016《菌落总数测定》，该方法需要采样，稀释，倾注平板，培养等一系列步骤，花费时间48小时。

这两个方法都需要大量人工操作，费时费力，且单增李斯特菌和细菌总数两项指标的检测还必须分别进行。

尽管目前有许多新的技术被用于单增李斯特菌或细菌总数的快速检测，但是这些技术难以用于同单增李斯特菌和细菌总数的多重检测。比如现有生物芯片法无法识别全部种类的细菌；PCR方法仅能实现不同种类细菌的多重检测，无法实现细菌总数的检测。

流式分析技术有实现单增李斯特菌和细菌总数指标的多重检测的潜力，但是由于单增李斯特菌特异性荧光探针的开发存在许多技术困难，目前尚未有相关报道。

综上所述，快速检测，同步多重检测，且能同时检测单增李斯特菌和细菌总数，是食品微生物检验领域的实际需要，也是技术难点。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种单增李斯特菌和细菌总数的快速同步多重检测方法，尤其是要满足以下要求：1、必须能够区分细菌和杂质；2、能够定量测量细菌总数；3、可以从总细菌中特异性识别并定量单增李斯特菌；4、快速同步得到检测结果。

本发明的第二目的是提供能达到上述目的的检测试剂盒。

本方法具有两个技术关键点：一是如何准确区分细菌和非细菌的颗粒；二是如何特异地识别单增李斯特菌。

针对上述问题，本发明人进行了如下工作：

1、开发能识别总细菌的荧光探针

由于细菌种类繁多，选用大肠杆菌作为革兰氏阴性菌的代表菌株，用金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌作为革兰氏阳性菌的代表菌株，用枯草芽孢杆菌作为芽孢形态细菌的代表菌株。拟通过对四个代表性菌株的研究，并对能够识别总细菌的荧光探针进行了开发和优化。

2、制备出适合的单增李斯特菌的特异性抗体

采用了偶联有绿色荧光探针的单增李斯特菌的抗体，对单增李斯特菌进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对单增李斯特菌的荧光进行分析。

适用于流式分析仪的单增李斯特菌抗体的筛选十分困难：