[发明专利]一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用

权利要求书

1.一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型的建立方法，其包括以下步骤：

1）将至少一个具有分化功能的表皮细胞包埋在凝固的基质胶A中；

2）采用第一培养基培养包埋在凝固的基质胶A中的表皮细胞1～3天，再换为第二培养基继续培养5～8天，获得包埋在凝固的基质胶A中的细胞球；其中所述第一培养基为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01%～1% BSA+0.2%～5% B-27细胞培养添加物+0.5%～1%谷氨酰胺添加剂+0.1～10 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μM Forskolin+50～200 ng/mL Wnt3a+20～100 ng/mL EGF+10～1000 U/mL青霉素+0.01～1 mg/mL链霉素；所述第二培养基为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01%～1% BSA+0.2%～5% B-27细胞培养添加物+0.5%～1%谷氨酰胺添加剂+0.1～10 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μM Forskolin+50～200 ng/mL Wnt3a+20～100 ng/mL EGF+0.1～5 µM A83-01+10～1000 U/mL青霉素+0.01～1 mg/mL链霉素；

3）将所述细胞球从凝固的基质胶A中游离出来，将游离出来的细胞球用含有癣菌分生孢子的基质胶B重悬并孵育使基质胶B凝固，使得细胞球和癣菌分生孢子包埋在凝固的基质胶B中；所述细胞球定义为表皮类似物，为实心球体结构，其外部环绕分布有由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；所述癣菌分生孢子分散在基质胶B中且未侵入表皮类似物的细胞层；其中所述基质胶A和基质胶B相同或不同；

4）采用第三培养基共培养包埋在凝固的基质胶B中的表皮类似物和癣菌分生孢子20～26小时，建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型；所述模型中包括包埋在凝固的基质胶B中的表皮类似物和由癣菌分生孢子生长产生的菌丝，其中：菌丝侵入球体结构外部的细胞层中的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层，表皮类似物的球体结构相对完整；其中所述第三培养基为：Advanced DMEM/F12培养基+0.01%～1% BSA+0.2%～5% B-27细胞培养添加物+0.5%～1%谷氨酰胺添加剂+0.1～10 mMN-乙酰基-L-半胱氨酸+1～10mM HEPES+5～20μM Forskolin+50～200 ng/mL Wnt3a+20～100 ng/mL EGF+0.1～5 µM A83-01。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述第一培养基为：AdvancedDMEM/F12培养基+0.1% BSA+1% B-27细胞培养添加物+1%谷氨酰胺添加剂+10 mM HEPES+1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10 µM Forskolin+100 ng/mL Wnt3a+50 ng/mL EGF+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素；

第二培养基为：Advanced DMEM/F12培养基+0.1% BSA+1% B-27细胞培养添加物+1%谷氨酰胺添加剂+10 mM HEPES+1 mM N-乙酰基-L-半胱氨酸+10 µM Forskolin+100 ng/mLWnt3a+50 ng/mL EGF+1µM A83-01+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL链霉素。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）中将所述细胞球从凝固的基质胶A中游离出来的具体操作为：将包埋有细胞球的基质胶A置于含有少量培养基的管中，将该管在冰上放置30-60分钟使凝固的基质胶A溶化游离出其中的细胞球，获得该细胞球。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3）中含有癣菌分生孢子的基质胶B中癣菌分生孢子的浓度为1×10⁵～3×10⁵个分生孢子/μl；

所述孵育的条件为：置于37±1℃的细胞培养箱中孵育5～10 min。