[发明专利]一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用

说明书

本发明公开一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的体外模拟皮肤癣菌感染的模型包括基质胶、包埋在凝固的基质胶中的表皮类似物和癣菌菌丝，其中表皮类似物呈相对完整的实心球体结构，其外部为环绕分布的由基底层细胞和基底上层细胞组成的细胞层，内部为角化样非细胞层；菌丝侵入球体结构外部的基底层细胞且未侵入或仅少量侵入基底上层细胞，并且未侵入球体结构内部的角化样非细胞层；其可以有效模拟皮肤癣菌感染正常皮肤组织的状态，并且该模型可以在相差显微镜下直接观察感染过程，并可以利用高通量RNA测序等组学方法检测感染情况，可以有效用于研究皮肤癣菌感染的致病机理和筛选抗癣菌药物。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种建立体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和在皮肤癣菌感染的致病机理研究和在抗癣菌药物筛选中的应用。

背景技术

皮肤癣菌感染，俗称“脚气病”，是最常见的人体真菌感染类型，感染通常局限于表皮层，绝大多数由特异性噬人表皮组织的红色毛癣菌引起。皮肤癣菌感染的临床及病理特征为慢性反复性感染，角化皮肤组织增厚、脱落，炎症反应较为轻微，但人体自身难以根除，病原体与人体宿主之间形成了较好的适应性。虽然并非严重的威胁生命的疾病，但这类感染经常性的引发人体局部疼痛不适，造成不良的社交后果，长期影响人的生活质量。然而，当前对于人体皮肤癣菌感染的致病机理尤其是其引发的慢性反复性感染且伴随皮肤轻微炎症的分子机制依然不清楚，而且也缺乏非常有效的根治性药物。解决这些问题有赖于合适的人皮肤癣菌感染疾病模型来对这类疾病进行深入的致病机理研究，进而用以发现新的治疗靶点和研发有效性药物。

目前，现有技术中有两大类经典的表皮模型用于皮肤癣菌感染的研究：1)二维培养的人原代角质细胞(皮肤干/祖细胞)，其仅具有单一细胞类型(类似于表皮的基底层干/祖细胞)，而缺乏体内表皮组织中如棘层细胞、颗粒层细胞以及角化层的非细胞物质等，该表皮模型不能模拟人体表皮组织的三维多细胞层有序的组织结构，因而难以真实再现人体表皮组织感染后的病理生理学反应，在皮肤癣菌致病机理研究中难以应用。2)气液相交培养方式产生的表皮类似物(文献1—FawayCambier L,Mignon B,Poumay Y,Lambert deRouvroit C.Modeling dermatophytosis in reconstructed human epidermis:A newtool to study infection mechanisms and to test antifungal agents.MedMycol.2017Jul 1；55(5):485-494.)，该文献1的表皮类似物(epidermis equivalent)中除了含有基底层干/祖细胞外、还包含分化的基底上层细胞，如棘层细胞、颗粒层细胞以及角化层的非细胞物质(即角化样非细胞层)等，而且这些细胞和组份在表皮类似物内有序排列成层状结构，如图1所示，该层状结构很好地模拟了体内表皮的组织结构特征，角化层朝向外部环境，基底层和基底上层等的细胞层处于内侧，作为仿生皮应用值得期盼。但是，利用这种结构建立的感染模型在皮肤癣菌感染后，在感染早期由于最外层角化层物质的阻挡，癣菌难以直接接触下层细胞，因而难以引发明显的细胞反应，也就阻碍了对于感染引发的细胞免疫响应研究；而当延长感染时间使癣菌可以穿透角化层物质直接接触细胞时，又会造成大量的癣菌繁殖并且紧紧黏附于表皮类似物的角化层物质而不利于使用高通量的组学方法(例如高通量RNA测序)进行感染机制的深入挖掘和新的致病机理的探索。另外，气液相交培养方式产生的模型的构建需要大量的起始皮肤细胞，且构建过程长而复杂，因而在皮肤癣菌感染的研究上难以大规模化应用；并且由于气液相交的培养方式的特殊性(即气液相交培养顶层不加液体，直接跟空气接触，下层加液体)，使得利用该方法建立的模型不易在显微镜下观察感染的进程。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型的建立方法，其包括以下步骤：

1)将至少一个具有分化功能的表皮细胞包埋在凝固的基质胶A中；