[发明专利]一种人工感染鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法

权利要求书

1.一种人工感染鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)草鱼暂养：将一龄或二龄体长10-12cm的健康无畸形草鱼置于曝气的养殖容器中暂养5-7天，每日早晚投喂两次，第二次喂食结束后换一半新的养殖水，人工感染前72h停止投喂；

(2)细菌培养：将嗜水气单胞菌接种于高压蒸汽灭菌后的NB肉汤培养基中，于28℃恒温培养箱中摇床培养16-18h，存放于4℃冰箱备用；

(3)菌液稀释：将步骤(2)中培养的菌液恢复至室温，用PBS将菌液母液分别稀释至10¹⁰cfu/mL、10⁸cfu/mL和10⁶cfu/mL数量级；

(4)人工感染：对步骤(1)中暂养后的草鱼分组注射步骤(3)中稀释菌液进行人工感染，采用相同的方法注射PBS作为对照；

(5)症状观察和抗性评定：每天观察步骤(4)中人工感染后的草鱼，及时清除死亡个体，从存活程度和表现症状判断草鱼对细菌性败血症的抗性。

2.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述养殖容器为清洁消毒处理过的50L塑料桶，放入30条草鱼和30L曝气养殖水，同时桶内放置有气石和控温装置。

3.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细菌培养的步骤为：用接种环挑取血平板上长势好且有明显溶血圈的单个嗜水气单胞菌菌落，将接种环深入到所述NB肉汤培养基中搅拌完成接种，于28℃恒温培养箱中摇床培养16-18h，存放于4℃冰箱备用。

4.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌液稀释采用逐级稀释法，具体为：取1.5mL试管加入900μL无菌PBS和100μL菌液，此为稀释10倍，再从该试管中吸取100μL溶液加入到另一个装有900μLPBS的试管中，此为稀释10²倍，同理继续向下稀释。

5.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(4)中，采用胸鳍基部注射，针头插入深度为1-1.2cm，注射量为0.1mL/条草鱼。

6.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述抗性评定的标准为：若在10⁶cfu/mL注射组中存在死亡个体，则存活的个体为抗细菌性败血症差的个体；若在10⁸cfu/mL注射组中存在死亡个体，则存活个体为抗细菌性败血症中等的个体；若在10¹⁰cfu/mL注射组中存在死亡个体，则存活个体为抗细菌性败血症强的个体。

7.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述死亡个体的表现症状包括：早期患病外部可见上下颌、眼睛、鳍条及腹腔两侧有轻度充血，肛门红肿，随着病情发展上述体表出血症状加剧，眼眶周围有充血，腹部肿大，解剖可见腹腔内有黄色透明或红色浑浊腹水，肠壁、肠系膜周围充血呈粉红或浅红色，肠内充血且无食物，少数肠内有气泡。

8.根据权利要求1所述鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述死亡个体无表现症状。