[发明专利]一种人工感染鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法

说明书

本发明公开了一种人工感染鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，属于水产动物种质资源鉴定技术领域。选用一龄或二龄体长10‑12cm的健康无畸形草鱼暂养5‑7天，将嗜水气单胞菌接种于高压蒸汽灭菌后的NB肉汤培养基中，于28℃恒温培养箱中摇床培养16‑18h，用PBS将菌液母液分别稀释至10¹⁰、10⁸和10⁶cfu/mL数量级，对暂养后的草鱼分组注射稀释菌液进行人工感染，从存活程度和表现症状判断草鱼对细菌性败血症的抗性。本发明的鉴定方法可在室内进行，受时间、空间和环境影响较小，且鉴定周期短，速度快，单人即可完成操作，节省人力物力，结果准确可靠。

技术领域

本发明属于水产动物种质资源鉴定技术领域，具体涉及一种人工感染鉴 定草鱼细菌性败血症抗性的方法。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodon idella)，中国四大家鱼之一，广泛分布于各大水 系，为中国淡水鱼主要养殖对象。但是，随着养殖数量和规模不断扩大以及 养殖环境不断恶化，草鱼的种质资源开始逐渐减少，鱼病也造成巨大养殖经 济损失，改善种质有助于养殖业的长期发展。选育草鱼抗病品种，并利用其 自身的遗传因素抗病是根本途径，其中良种选育的关键在于对抗细菌性败血 症草鱼的鉴定。

现有技术中，通过自然感染即在养殖水中由嗜水气单胞菌引起的细菌性 败血症爆发后，经过自然选择使抗病的个体存活，从而鉴定筛选出抗病个体。 但该方法耗时长、代价高、受气候和环境等因素的影响较大，且需要较大的 空间，为防止水体对周围环境产生影响，在筛选鉴定结束后，还需要对池塘 进行全面消毒，工序繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工感染鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方 法，通过人工感染不同浓度梯度的嗜水气单胞菌菌液，观察死亡和存活个体 和表现症状判断草鱼细菌性败血症抗性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种人工感染鉴定草鱼细菌性败血症抗性的方法，包括以下步骤：

(1)草鱼暂养：将一龄或二龄体长10-12cm的健康无畸形草鱼置于曝气 的养殖容器中暂养5-7天，每日早晚投喂两次，第二次喂食结束后换一半新的 养殖水，人工感染前72h停止投喂；

(2)细菌培养：将嗜水气单胞菌接种于高压蒸汽灭菌后的NB肉汤培养 基中，于28℃恒温培养箱中摇床培养16-18h，存放于4℃冰箱备用；

(3)菌液稀释：将步骤(2)中培养的菌液恢复至室温，用PBS将菌液 母液分别稀释至10¹⁰cfu/mL、10⁸cfu/mL和10⁶cfu/mL数量级；

(4)人工感染：对步骤(1)中暂养后的草鱼分组注射步骤(3)中稀释 菌液进行人工感染，采用相同的方法注射PBS作为对照；

(5)症状观察和抗性评定：每天观察步骤(4)中人工感染后的草鱼， 及时清除死亡个体，从存活程度和表现症状判断草鱼对细菌性败血症的抗性。

根据本发明的一些实施例，步骤(1)中，所述养殖容器为清洁消毒处理 过的50L塑料桶，放入30条草鱼和30L曝气养殖水，同时桶内放置有气石和 控温装置。

根据本发明的一些实施例，步骤(2)中，所述细菌培养的步骤为：用接 种环挑取血平板上长势好且有明显溶血圈的单个嗜水气单胞菌菌落，将接种 环深入到所述NB肉汤培养基中搅拌完成接种，于28℃恒温培养箱中摇床培 养16-18h，存放于4℃冰箱备用。

根据本发明的一些实施例，步骤(3)中，所述菌液稀释采用逐级稀释法， 具体为：取1.5mL试管加入900μL无菌PBS和100μL菌液，此为稀释10倍， 再从该试管中吸取100μL溶液加入到另一个装有900μLPBS的试管中，此为 稀释10²倍，同理继续向下稀释。