[发明专利]一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用

说明书

一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法及其应用，它涉及一种试纸的制备方法以及应用。本发明为了解决目前阪崎克罗诺杆菌的检测方法中存在的检测时间长、成本高问题，以及提高检测方法的灵敏度的问题。试纸的制备：一、制备单克隆抗体；组装SERS免疫探针；三、试纸条的组装；所述的试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用。本发明的试纸测定时间短且易于操作，成本低，具有优异的灵敏度，能够定量检测，本发明的试纸可以简便、快速地定量检测工业.食品中阪崎克罗诺杆菌。

技术领域

本发明涉及一种试纸的制备方法以及应用。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)，曾命名为Enterobacter sakazakii，是引起诸如菌血症，新生儿脑膜炎和坏死性小肠结肠炎等传染病的病原体，致死率很高。婴幼儿配方奶粉经常被阪崎克罗诺杆菌污染。欧盟(欧洲委员会，2005年)规定食品中提取30×10克婴幼儿配方奶粉不得存在阪崎克罗诺杆菌。

当前，关于阪崎克罗诺杆菌的检测方法包括有生化反应或聚合酶链反应(PCR)技术、PCR方法、实时荧光PCR方法等，但是这些方法普遍存在检测时间长、检测成本高的问题，基于免疫识别的免疫层析试纸条由于其具有高特异性，以及易于现场检测的特点，引起了越来越多的关注，然而，对于病原体检测，需要提高试纸条的敏感性和准确性。在试纸条检测中，用单克隆抗体标记金纳米颗粒(AuNPs)，导致抗体与抗原特异性结合时由于胶体金的积聚而发生颜色变化实际上，在肉眼观察到颜色变化之前，抗原/抗体已经有少量的结合。因此，在发生少量的抗原/抗体结合时，就需要检测到信号以此来提高检测方法的灵敏度，但是目前的检测方法普遍存在灵敏度低的问题，无法准确的完成检测。

发明内容

本发明为了解决目前阪崎克罗诺杆菌的检测方法中存在的检测时间长、成本高、只能定性检测问题，以及为了提高检测方法的灵敏度，实现定量检测，而提供了一种检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法以及应用。

本发明检测阪崎克罗诺杆菌试纸的制备方法，按照以下步骤进行：

步骤一、利用杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020242，保藏日期为2020年12月9日；

步骤二、拉曼报告分子、单克隆抗体添加到胶体金溶液中，得到SERS免疫探针；

步骤三、试纸条的组装；即得到了检测阪崎克罗诺杆菌的试纸。

上述试纸在检测阪崎克罗诺杆菌中的应用，具体的应用方法：将上述的阪崎克罗诺杆菌试纸条浸入含有待测物的SERS免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了阪崎克罗诺杆菌的检测。

上述步骤一中的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

本发明的试纸是基于免疫层析和表面增强拉曼散射(SERS)的免疫层析试纸，对阪崎克罗诺杆菌的检测具有高度特异性，并通过测定SERS信号大大提高该方法的灵敏度，本发明可以根据测试线的颜色变化在12分钟内通过视觉评估阪崎克罗诺杆菌是否存在，测试线上免疫探针(mAb-Au-PATP)产生的拉曼信号强度与样品中的阪崎克罗诺杆菌浓度高度相关，从而可以准确定量阪崎克罗诺杆菌浓度。本发明的定量检测范围为10²～10⁷cfu/mL，LOD为201cfu/mL，准确度为99～104％。本发明的试纸测定时间短且易于操作，成本低，本发明的试纸中拉曼报告分子标记胶体金标记抗体，具有优异的灵敏度，实现了定量检测，本发明的试纸可以简便、快速地定量检测工业食品中阪崎克罗诺杆菌。

附图说明

图1是免疫探针的制备流程图；

图2是不同阪崎克罗诺杆菌浓度检测结果图；

图3是拉曼图；