[发明专利]一种DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法

权利要求书

1.一种DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(a)将带有5’端序列片段的哑铃状DNA探针、测试样品、反应缓冲液进行混合，在35-40℃下孵育20-40min；所述带有5’端序列片段的哑铃状DNA探针的序列从5’至3’为TTAACGACCATTCAAACGCACTGATGGTTGCCAACCACAAACGGCAA；TTAACG为游离的5’末端序列，带下划线的字母表示引物的结合区域；

(b)将T4DNA连接酶及(a)中所述的反应缓冲液添加到(a)所得的最终溶液中，在20-25℃下孵育35-45min；

(c)将引物和滚环扩增混合物滴入(b)所得的最终溶液中以启动滚环扩增反应；引物的序列从5’至3’为CAGTGCGTT；

(d)将(c)中所得的最终溶液在读板仪上进行快速和高通量检测，在450-550nm之间进行激发和发射；

(e)将(c)中所得的最终溶液用荧光光谱仪测量荧光；

(f)重复上述步骤，检测不同浓度的测试样品的荧光值，通过绘制关系图，计算FEN1浓度与荧光强度之间的关系；

(g)将待测样品作为测试样品，进行步骤(a)-(e)，将测得的荧光值与步骤(f)获得的关系图进行对比，计算待测样品中FEN1的浓度；

所述方法为非疾病的诊断目的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中哑铃状DNA探针浓度范围为5-15nM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中反应缓冲液为含有KCl、Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄的溶液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中T4DNA连接酶的浓度范围为3-7U/μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中RCA混合物中含有phi29 DNA聚合酶、dNTPs、phi29反应缓冲液和SGI。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)中分别在497nm和530nm处进行激发和发射。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中荧光光谱仪在λ＝497nm的波长下测量荧光。