[发明专利]一种DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法

说明书

本发明公开了一种DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法，该方法将带有5’端序列片段的哑铃状DNA探针、测试样品和反应缓冲液混合孵育，然后，将T4DNA连接酶及反应缓冲液添加到溶液中，孵育，再将引物和RCA混合物滴入上述所得的样品中以启动RCA反应，测量上述所得的样品的荧光，最后检测不同浓度的测试样品的荧光值绘制浓度与荧光强度之间的关系图，检测待测样品的荧光值，代入关系图计算出FEN1的浓度。本发明的FEN1检测方法具有灵敏度高，选择性强，成本低的优点，能够实现肿瘤中的FEN1高效检测。

技术领域

本发明涉及一种生物传感器检测某种目标物的方法，具体为一种DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法。

背景技术

生物标志物在诊断和预后中的关键作用已经得到普遍的认可，而其进行准确检测的优势在精密医学的发展中也具有重要的意义。FEN1(Flap endonuclease 1)在DNA的复制和修复过程中起到了重要的作用，同时，由于癌细胞具有旺盛的生命力，它们往往会在人体中快速复制，导致DNA聚合酶的过度表达，从而导致FEN1的过度表达。因此，对FEN1的特异性检测可以精准定位癌细胞，进行后续治疗，具有重大意义。但当前，用于检测FEN1的分析技术发展仍然薄弱，包括Western blot和ELISA在内的多种常规检测方法无法满足临床需求，因此，非常需要能够提高性能和降低成本的新的检测技术的发明。

从功能性核酸和DNA纳米技术的可编程性出发，可以合理设计DNA的构象和功能来进行识别，催化和计算。其中，较为重要的应用在于，利用滚环扩增(RCA)，指数等温扩增(EXPAR)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等扩增技术大大改善了生物传感器的性能。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法，该方法能够特异性识别目标物FEN1，增强检测的灵敏度和准确性。

技术方案：本发明所述的DNA连接反应与滚环扩增联用的生物传感器检测结构特异性核酸酶FEN1的方法，具体包括如下步骤：

(a)将带有5’端序列片段的哑铃状DNA探针、测试样品、反应缓冲液进行混合，在35-40℃下孵育20-40min；

(b)将T4DNA连接酶及(a)中所述的反应缓冲液添加到(a)所得的最终溶液中，在20-25℃下孵育35-45min；

(c)将引物和滚环扩增混合物滴入(b)所得的最终溶液中以启动滚环扩增反应；

(d)将(c)中所得的最终溶液在读板仪上进行快速和高通量检测，在450-550nm之间进行激发和发射；

(e)将(c)中所得的最终溶液用荧光光谱仪测量荧光；

(f)重复上述步骤，检测不同浓度的测试样品的荧光值，通过绘制关系图，计算FEN1浓度与荧光强度之间的关系；

(g)将待测样品作为测试样品，进行步骤(a)-(e)，将测得的荧光值与步骤(f)获得的关系图进行对比，计算待测样品中FEN1的浓度。

所述的方法，步骤(a)所述的带有游离末端的哑铃状DNA探针的序列为：

斜体字母表示游离的5’末端序列，带下划线的字母表示引物的结合区域。

所述的方法，步骤(a)中哑铃状DNA探针浓度范围为5-15nM。

所述的方法，步骤(a)中反应缓冲液为含有KCl、Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄的溶液。