[发明专利]一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法

权利要求书

1.一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将TCR和pMHC序列调整为组成型启动子元件诱导表达，并将该元件整合表达到酵母基因组中，将TCR和pMHC蛋白展示到不同交配型酵母表面；

所述S1的步骤包括：

首先将所要研究的TCR序列构建成scTCR形式，获得pMHC的肽段突变文库；

改造pMHC文库构建所需接收载体ysynalpha_DEST，获得ysyna-TCR和ysynalpha-pMHC的载体；

所述ysyna-TCR和ysynalpha-pMHC的载体的制备方法为：用NheI和XhoI限制性内切酶分别将合成的TCR序列和ysyna_DEST质粒、 pMHC序列和改造的ysynalpha_DEST质粒双酶切，水浴锅酶切后，用DNA胶在紫外灯下切取目的片段，并回收相应的片段；室温连接；转化到大肠杆菌DH5α中；

所述pMHC的肽段是通过Linker序列将肽段-MHC重链轻链进行连接，与AGA2的N端进行融合表达；所述肽段是合成长引物后通过PCR退火延伸的方式构建的；

所述pMHC文库构建所需接收载体ysynalpha_DEST改造方法为：通过同义突变移除载体骨架上的5个BSAI位点，并且在MHC上肽段整合的位置引入2个BSAI位点；

获得ysyna-TCR的载体后，用PmeI进行酶切，将包括ARS314、TCR、TRP和荧光蛋白的片段酶切下来；胶回收得到片段；ysynalpha-pMHC肽段突变库的载体，同样用PmeI酶切；切胶回收；

整合TCR到敲除Sag1基因的MATa型酵母中，获得表达TCR序列的酵母菌株；

整合pMHC到MATalpha酵母菌株中，获得pMHC的展示文库；

整合表达后直接在完全培养基YPD中培养就可以诱导酵母展示目标TCR和pMHC；

培养过夜后，转接，分时间段取样进行流式分析，检测TCR和pMHC在酵母表面的展示水平，选定最高展示水平时间点做后续交配实验；

S2、利用整合TCR和pMHC的不同交配型酵母进行酵母交配实验；

所述S2的步骤包括：

将构建好的表达TCR和展示pMHC的菌株过夜培养；

将过夜培养的菌株进行转接，培养后进行酵母交配实验；

控制交配的OD条件，包括起始浓度、展示TCR的a型酵母投入量、展示pMHC的alpha酵母投入量和培养基体积，在深孔板中，进行酵母交配实验，混合培养，获得TCR-pMHC介导形成的二倍体信号；

S3、二倍体的筛选和二代测序。

2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法，其特征在于，所述MATa型酵母同时整合表达了红色荧光蛋白，可以在后续流式实验中检测到红色荧光；所述MATalpha酵母同时整合表达了一个蓝色荧光蛋白，可以在后续流式实验中检测到蓝色荧光。

3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法，其特征在于，

所述TCR序列构建成scTCR形式的方法为酵母定向法；采用Vβ-Linker（GSADDAKKDAAKKDGKS）–Vα形式组装。

4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法，其特征在于，所述整合TCR到敲除Sag1基因的MATa型酵母中和整合pMHC到MATapha酵母菌株中的具体操作步骤如下：

利用常规醋酸锂转化法，将TCR序列转化到MATa菌株中，pMHC序列转化到MATalpha菌株中；

通过SC-TRP平板筛选单克隆；

所述整合TCR到敲除Sag1基因的MATa型酵母中的正确菌株构建是挑取单克隆直接划线培养于YPD平板上，分离单克隆用于后续实验；用刮刀刮取所有整合pMHC的MATalpha酵母菌落，离心，重悬在SC-TRP培养基中以获得PMHC肽段突变文库；冻存。