[发明专利]一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法有效
申请号: | 202011473454.2 | 申请日: | 2020-12-15 |
公开(公告)号: | CN112501269B | 公开(公告)日: | 2022-02-18 |
发明(设计)人: | 蓝勋;王莉惠 | 申请(专利权)人: | 清华大学 |
主分类号: | C12Q1/6869 | 分类号: | C12Q1/6869;C12N1/19;C12N15/12 |
代理公司: | 苏州科洲知识产权代理事务所(普通合伙) 32435 | 代理人: | 周亮;李奎锋 |
地址: | 100084*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 鉴定 亲和力 tcr 抗原 交叉 反应 活性 方法 | ||
1.一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、将TCR和pMHC序列调整为组成型启动子元件诱导表达,并将该元件整合表达到酵母基因组中,将TCR和pMHC蛋白展示到不同交配型酵母表面;
所述S1的步骤包括:
首先将所要研究的TCR序列构建成scTCR形式,获得pMHC的肽段突变文库;
改造pMHC文库构建所需接收载体ysynalpha_DEST,获得ysyna-TCR和ysynalpha-pMHC的载体;
所述ysyna-TCR和ysynalpha-pMHC的载体的制备方法为:用NheI和XhoI限制性内切酶分别将合成的TCR序列和ysyna_DEST质粒、 pMHC序列和改造的ysynalpha_DEST质粒双酶切,水浴锅酶切后,用DNA胶在紫外灯下切取目的片段,并回收相应的片段;室温连接;转化到大肠杆菌DH5α中;
所述pMHC的肽段是通过Linker序列将肽段-MHC重链轻链进行连接,与AGA2的N端进行融合表达;所述肽段是合成长引物后通过PCR退火延伸的方式构建的;
所述pMHC文库构建所需接收载体ysynalpha_DEST改造方法为:通过同义突变移除载体骨架上的5个BSAI位点,并且在MHC上肽段整合的位置引入2个BSAI位点;
获得ysyna-TCR的载体后,用PmeI进行酶切,将包括ARS314、TCR、TRP和荧光蛋白的片段酶切下来;胶回收得到片段;ysynalpha-pMHC肽段突变库的载体,同样用PmeI酶切;切胶回收;
整合TCR到敲除Sag1基因的MATa型酵母中,获得表达TCR序列的酵母菌株;
整合pMHC到MATalpha酵母菌株中,获得pMHC的展示文库;
整合表达后直接在完全培养基YPD中培养就可以诱导酵母展示目标TCR和pMHC;
培养过夜后,转接,分时间段取样进行流式分析,检测TCR和pMHC在酵母表面的展示水平,选定最高展示水平时间点做后续交配实验;
S2、利用整合TCR和pMHC的不同交配型酵母进行酵母交配实验;
所述S2的步骤包括:
将构建好的表达TCR和展示pMHC的菌株过夜培养;
将过夜培养的菌株进行转接,培养后进行酵母交配实验;
控制交配的OD条件,包括起始浓度、展示TCR的a型酵母投入量、展示pMHC的alpha酵母投入量和培养基体积,在深孔板中,进行酵母交配实验,混合培养,获得TCR-pMHC介导形成的二倍体信号;
S3、二倍体的筛选和二代测序。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法,其特征在于,所述MATa型酵母同时整合表达了红色荧光蛋白,可以在后续流式实验中检测到红色荧光;所述MATalpha酵母同时整合表达了一个蓝色荧光蛋白,可以在后续流式实验中检测到蓝色荧光。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法,其特征在于,
所述TCR序列构建成scTCR形式的方法为酵母定向法;采用Vβ-Linker(GSADDAKKDAAKKDGKS)–Vα形式组装。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法,其特征在于,所述整合TCR到敲除Sag1基因的MATa型酵母中和整合pMHC到MATapha酵母菌株中的具体操作步骤如下:
利用常规醋酸锂转化法,将TCR序列转化到MATa菌株中,pMHC序列转化到MATalpha菌株中;
通过SC-TRP平板筛选单克隆;
所述整合TCR到敲除Sag1基因的MATa型酵母中的正确菌株构建是挑取单克隆直接划线培养于YPD平板上,分离单克隆用于后续实验;用刮刀刮取所有整合pMHC的MATalpha酵母菌落,离心,重悬在SC-TRP培养基中以获得PMHC肽段突变文库;冻存。
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