[发明专利]一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法

说明书

本发明涉及一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法，将TCR和pMHC序列调整为组成型启动子诱导表达，并将该元件整合表达到酵母基因组中，包括以下步骤：将TCR和pMHC蛋白展示到不同交配型酵母表面；利用整合TCR和pMHC的不同交配型酵母进行酵母交配实验；二倍体的筛选和二代测序。本发明能够提供一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法，无需纯蛋白，仅需合成DNA序列，利用Golden‑gate克隆方法，一周内可获得更全的抗原突变文库，方便快捷；借助酵母交配系统，突破在细胞水平上筛选的限制，操作步骤简化，可短时间内获得与特定TCR相互作用的抗原序列，实验结果可靠。

技术铃域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定高亲和力TCR抗原交叉反应活性的方法。

背景技术

TCR是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子。在适应性免疫系统中，TCR特异性识别由组织相容复合物分子提呈的抗原分子多肽(pMHC)，从而激活T细胞，产生免疫效应。肿瘤细胞免疫疗法-TCR-T疗法就是利用与目标肿瘤抗原特异性结合的T细胞，杀伤恶性细胞的治疗方法。体外进化出的高亲和力的TCR能够提高改造T细胞的抗肿瘤能力，但是也会由于抗原交叉反应活性问题，识别非目标抗原，给病人造成严重的副作用。

目前，研究TCR抗原交叉反应活性的方法之一是利用纯化的MHC-抗原多聚体进行研究。依赖于UV-诱导快速实现抗原肽替换技术和多色荧光编码技术，可以同时检测15个抗原的T细胞免疫反应。Bentzen课题组利用开发的DNAbarcode标记的MHC多聚体技术，鉴定了16个不同TCR对1000多种不同pMHC的识别情况。但是这类方法必须进行MHC四聚体蛋白纯化，费时费力，并且没有经验的课题组很难快速构建相应的四聚体蛋白。商业购买一个抗原表位的四聚体就需花费1万多，这使得抗原筛选通量大大受限。

第二种方法是利用呈递目标抗原的细胞进行研究。如Rosenberg团队开发的，利用表达新抗原的APC进行筛选，抗原表达方法可通过负载新抗原肽段或合成串联性基因来实现。近年来研究者在细胞呈递MHC技术的基础上，开发了T-Scan和胞啃技术来提高T细胞识别抗原的筛选通量。尽管这种方法非常好地反映了体内TCR-抗原互作的真实情况，但是细胞培养需要花费较多的时间与金钱。

第三种方法是Garcia课题组和赵慧敏课题组等一些研究人员，已经成功将肽段与I型或II型MHC共价连接，构建成单链的形式展示到酵母表面，无需蛋白纯化，即可以获得大量呈递不同抗原的pMHC，用于研究感兴趣TCR的交叉反应活性。但是这种方法需要将感兴趣的TCR进行体外纯化制备成为TCR四聚体，现在该项核心技术目前仅被几个课题组掌握，现在没有任何商业化的产品。

Klavins课题组报道了通过改造酵母交配系统高通量检测蛋白间相互作用的方法。在酵母交配的过程中，不同交配型酵母在信号素的作用下，会极性生长，相互靠近，产生“shmoo”形态，之后通过不同交配型酵母接触位置细胞壁上的凝集素相互结合，介导下游交配信号，细胞融合。作者将介导细胞融合的配对凝集素中的sag1敲除，通过展示在酵母细胞壁外的外源蛋白介导细胞融合，将蛋白相互作用强度与酵母交配联系起来，在无需纯化蛋白的情况下，高通量并定量表征蛋白质间的相互作用。文章实现了在一次交配实验中，鉴定出包含数千对相互作用的蛋白互作网络。但是TCR-pMHC亲和力很低，筛选的难度更高，噪音更大。该方法并没有用于TCR-pMHC相互作用方面。