[发明专利]精子质膜保护剂HEPES/BSA及染色液和染色方法

说明书

本发明公开了一种用于精子活率检测的精子质膜保护剂HEPES/BSA及染色液和染色方法，该保护剂HEPES/BSA包含：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D‑果糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和水；其中，所述4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D‑果糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁的浓度分别为10mmol·L^‑1、1g·L^‑1、14mmol·L^‑1、130mmol·L^‑1、4mmol·L^‑1、1mmol·L^‑1、0.5mmol·L^‑1。本发明的精子质膜保护剂HEPES/BSA及其染色液不仅能够提高精子活率检测结果准确性和稳定性，而且能够有效减少精子凝聚成团、减缓抹片干燥速度。

技术领域

本发明涉及一种用于精子活率检测的染色液，具体涉及一种精子质膜保护剂HEPES/BSA及染色液和染色方法。

背景技术

精子质膜完整性是维持精子正常生理功能的基础。通常认为，细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。因此，精子膜的完整性常作为评价精子活率的基本指标。非荧光染料染色是目前判断精子质膜完整性最简便的方法之一。目前，国际上主要采用的精子活率检测方法——非荧光染料染色法的基本原理是：细胞损伤或死亡时，染液可穿透细胞膜，与DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以通过显微镜观察鉴别死细胞与活细胞。死精子质膜丧失选择通透性功能，从而使染料可透过质膜进入精子，而活精子拒染。

目前，生产和实验室最常使用的非荧光染料有：0.4％台盼蓝、0.5％伊红、0.67％伊红+10％苯胺黑(WHO人精子活率检测标准方法)。0.5％伊红作为国际常用检测精子活率的染料，使用设备简单，但操作比较繁琐，且对精子有毒害作用，易高估死精子比例，误差较大。另外，伊红浓度越大、染色时间越长，精子聚集成团的现象越明显，且不易辨别精子形态和染色情况。0.67％伊红+10％苯胺黑是在伊红染色法上的进一步优化，相比于伊红，能够有效避免精子聚集现象，但该方法依然存在着易高估死亡精子的问题。0.4％台盼蓝染色过程迅速，可在几分钟内对细胞进行染色分析。但是，台盼蓝染液浓度和染色时间对检测结果具有较大影响，精子容易凝聚成团。

发明内容

本发明的目的是提供一种精子质膜保护剂HEPES/BSA及染色液和染色方法，解决现有对精子活率检测中存在凝聚成团以及精子活率检测准确性和可靠性问题。该发明不仅能够提高精子活率检测结果准确性和稳定性，而且能够有效减少精子凝聚成团、减缓抹片干燥速度，易于操作。

为了达到上述目的，本发明提供了一种精子质膜保护剂HEPES/BSA，该保护剂HEPES/BSA包含：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D-果糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和水；其中，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸、牛血清白蛋白、D-果糖、氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁的浓度分别为10mmol·L^-1、1g·L^-1、14mmol·L^-1、130mmol·L^-1、4mmol·L^-1、1mmol·L^-1、0.5mmol·L^-1。

本发明的保护剂中Hepes及BSA能维持溶液pH值，保护精子质膜完整性。D-果糖为精子提供能量；氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁主要维持溶液的离子平衡。

本发明的另一目的是提供一种稳定高效检测精子活率的染色液，该染色液包含：台盼蓝、PBS缓冲液和所述的精子质膜保护剂HEPES/BSA；其中，所述台盼蓝的浓度为0.4～0.8％。

优选地，所述台盼蓝和HEPES/BSA保护液用量比为1～2g：125mL。

本发明的另一目的是提供一种稳定高效检测精子活率的方法，该方法采用所述的染色液对待检测的精子样品进行染色。