[发明专利]一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备

权利要求书

1.一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备，其特征在于：所述试纸盒包括酶标板、诺氟沙星标准品、诺氟沙星抗体工作液、诺氟沙星酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液；

所述酶标板的制备方法包括以下步骤：

一、包被抗原；

二、包被液；

三、酶标板包被；

所述诺氟沙星抗体工作液的制备方法包括以下步骤：

1)单克隆抗体；

2)一抗工作液；

3)二抗工作液。

2.根据权利要求1所述的一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备，其特征在于：所述包被抗原制备包括以下步骤：

C1、采用琥珀酸酐法得到带羧基的诺氟沙星半抗原衍生物，

C2、取0.05mmol带羧基的诺氟沙星半抗原衍生物与载体蛋白BSA，按10：1的结合比混合0.01mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CB)；

C3、加入0.15mmol碳二亚胺，搅拌置室温反应24h；

C4、最后于0.2mol/L pH 7.6的PBS缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，获得包被抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于-20℃保存备用。

3.根据权利要求2所述的一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备，其特征在于：所述包被液的制备步骤包括用0.01mol/L pH 9.6的碳酸盐(CB)缓冲液作为包被液，将诺包被抗原稀释成1：10000比例，100μL/孔，温度4℃，避光孵育过夜。

4.根据权利要求3所述的一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备，其特征在于：所述酶标板包被包括以下步骤：

D1、在制备包被抗原的同时，将酶标板置入溶液内；

D2、避光孵育过夜后，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的洗涤液300μL/孔，洗板2次，每次持续时间30S，

D3、然后加入1％牛血清白蛋白(BSA)+10蔗糖+1％环糊精(PBST)，180μL/孔，温度37℃放置1.5h；

D4、甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置真空干燥，抽检合格后将酶标板真空密封于2-10℃条件下保存。

5.根据权利要求1所述的一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备，其特征在于：所述单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

E1、选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μg与等量完全弗氏佐剂混合；

E2、采用腹腔注射进行初次疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫；

E3、如每次均免疫，6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫；

E4、3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存；

E5、先腹腔注射0.5ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞；

E6、接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次；

E7、将腹水以4000rpm的转速离心15min，收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20℃保存备用。

6.根据权利要求5所述的一种食物中的诺氟沙星残留酶联免疫检测试纸盒的制备，其特征在于：

所述一抗稀释的方法为：将单克隆抗体用抗体稀释液稀释成1：80000比例制备；

所述二抗稀释的方法为：将单克隆抗体用酶标二抗加稀释液稀释成1：3000比例。