[发明专利]一种月柿离体再生体系建立方法

说明书

本发明公开了一种月柿离体再生体系建立方法，涉及植物培育技术领域，其技术方案要点是：初代培养接种到DKW+ZT 0.5～3.0mg/L的基本培养基中培养20～30d；继代培养接种到DKW+ZT 0.5～3.0mg/L+IAA 0.05～0.5mg/L的基本培养基中进行培养；愈伤组织诱导接种在1/2DWK+ZT 0.5～3.0mg/L+TDZ 0.25～2.0mg/L的基本培养基中暗培养20～35d后，光下诱导愈伤组织和不定芽的形成；不定芽再生接种在1/2DKW+ZT 0.5～4.0mg/L分化培养25～40d；接种在1/2DKW+IAA 0.5～4.0mg/L的基本培养基中，暗培养5～10d后，再光下培养20～35d。本发明能够高效、稳定的完成月柿离体再生培养，繁殖率高、质量高、培养时间短，为通过基因工程进行涩柿遗传改良奠定了基础。

技术领域

本发明涉及植物培育技术领域，更具体地说，它涉及一种月柿离体再生体系建立方法。

背景技术

柿隶属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros Linn.)，作为果树栽培的代表种，在我国栽培已有2000年以上的历史。柿子富含营养，鲜果色泽艳丽，味道甜美，营养成分丰富，柿果也极易于加工，可以用于做柿饼、柿干、柿茶、柿醋和柿酒。还可替代粮食，与栗、枣齐名，素有“铁杆庄稼”、“木本粮食”的美誉。柿子的多种成分可以入药，包括柿霜，柿蒂，柿根，柿叶，可以用于解酒降压。近些年来，美国、澳大利亚、巴西、智利、新西兰等国家也开始大量栽培柿子。据联合国粮农组织2013年统计，2012年我国柿的总产量为3386000吨，占世界总产量的76.05％，2012年我国柿的总种植面积为734800公顷，占世界栽培总面积的90.13％，无论是柿产量还是种植面积，我国都居世界首位。

涩柿果实成熟后需进行人工脱涩才能食用，且很多时候脱涩不完全，食用后果肉中残存的可溶性单宁会与胃粘膜蛋白结合，形成“胃柿石”；而完全甜柿果实成熟后不需人工脱涩即可脆食，果实货架期长，因而更具商品价值，是柿育种的终极目标。目前，我国柿栽培品种绝大多数为完全涩柿，如月柿、磨盘柿和富平尖柿等已经占有较大的市场份额，但每年的采后人工脱涩耗费大量的人力物力，增加了生产成本，这大大阻碍了我国柿产业的发展。因此，利用植物基因工程技术，在保持其他优良性状的前提下对涩柿进行“甜柿化”遗传改造，将大大加快我国完全甜柿育种进程，促进我国柿产业的发展。

目前，第一方面，对于柿的初代培养，多数研究在取材时为避免内生菌的污染而往往会选取当年抽生的嫩枝，一般长3～5cm，研究发现过小的茎段在灭菌时极易被杀死，同时茎段过短，节间距小，芽密集，不利于茎段上芽的萌发生长。第二方面，不同植物生长调节剂及、浓度对柿的初代培养影响较大，其中BA和ZT最为常见，已有研究表明许多柿树品种植物在含BA的培养基中不能正常生长，BA能诱发多酚氧化酶活性，极易导致初代苗基部褐化，而增加死亡率。第三方面，月柿组培苗在MS(1/2N)基本培养基早期继代生长良好，随着继代次数的增加，组培苗开始普遍存在茎段生长而不长叶片的现象，叶片小且玻璃化，大部分叶片成簇生状。第四方面，已有研究表明月柿继代培养中ZT浓度过高极易导致茎基部愈伤组织的形成和过度生长，进而抑制腋芽的萌发抽生以及阻碍叶片的生长。

综上，现有的柿初代培养、继代培养存在较多的限制，无法直接应用到通过植物基因工程技术在保持其他优良性状的前提下对涩柿进行遗传改造过程中。因此，如何研究设计一种高效、稳定的月柿离体再生体系建立方法是我们目前急需解决的问题，为通过基因工程进行涩柿遗传改良奠定了基础。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种月柿离体再生体系建立方法。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种月柿离体再生体系建立方法，包括以下步骤：

S101，初代培养：

将清洗后的嫩茎切割成各含2个腋芽的茎段，最后接种到DKW+ZT 0.5～3.0mg/L的基本培养基中培养20～30d；

S102，继代培养：