[发明专利]一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了利用表达血管紧张素转移酶ACE抑制肽的乳酸菌治疗高血压，本发明提供了一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌，该乳酸菌基因工程菌的构建方法是将混合多肽序列(MP)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因在乳酸菌中共表达。这种构建方式不但能够克服短肽不易表达的问题，有效的提高乳源ACE抑制肽的产量，还可以使混合串联多肽能够耐受菌体的酶系统而不易被降解，获得的乳酸菌基因工程菌可用于制备具有降血压功能的食品或药品。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

高血压具有很高的发病率，并且常常伴有心血管疾病和肾脏疾病的发生，正严重威胁着全球公共健康。据报道超过25％的成年人都经受着高血压的影响。按照目前的趋势发展，这一数字到2025年将达到30％，约15亿人口。高血压患者中，轻度高血压患者约占70％，已经成为了重症高血压患者庞大后备军。预防和治疗高血压对提高人类的健康水平，延长寿命有着重要的意义。因此构建降血压乳酸菌株具有重要意义。

血管紧张素转移酶(Angiotensin I converting enzyme,ACE)是一种二肽羧化金属肽酶，一方面它能促使血管平滑肌收缩，导致血压升高；另一方面ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肽失活，同样又引起血压升高。因此对ACE的抑制作用被认为是治疗高血压的有效手段。ACE的抑制也已经变成了调节血压的重要目标。乳酸菌中分离出的一些肽具有抑制ACE活性的特性，因此可以被当作降血压药物使用。

发明内容

为利用表达血管紧张素转移酶ACE抑制肽的乳酸菌治疗高血压，本发明提供了一种具有降血压功能的乳酸菌基因工程菌，所述乳酸菌基因工程菌是将共表达混合串联多肽(MP)和绿色荧光蛋白(GFP)的乳酸菌经乳链菌肽Nisin诱导后获得的，其中，混合串联多肽MP是由三种不同的牛乳酪蛋白源的血管紧张素转移酶ACE抑制肽合成的含有乳酸乳球菌偏爱密码子的混合串联多肽。

进一步地限定，编码混合串联多肽MP的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地限定，编码绿色荧光蛋白GFP的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了所述乳酸菌基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

步骤一、在编码混合串联多肽MP的基因中添加BglII和SpeI的酶切位点，并引入限制性内切酶NsiI和EcoRI的识别序列；

步骤二、设计用于扩增GFP基因的引物并扩增GFP，在获得的目的基因中引入限制性内切酶BglII和SpeI的识别序列，将所获基因片段与克隆载体pSIMPLE18 EcoRV/BAP一起连接转化大肠杆菌TOP10，筛选出阳性转化子；

步骤三、将步骤二所获阳性转化子经NsiI和EcoRI双酶切后获得的目的片段与表达载体pSEC-E7经NsiI和EcoRI双酶切后获得的目的片段连接并构建重组表达质粒pUC57-MP:GFP；

步骤四、利用电转化法将步骤三所获重组表达质粒pUC57-MP:GFP转入乳酸菌感受态细胞，经PCR鉴定获得含有重组质粒的乳酸菌pSEC-MP:GFP；

步骤五、培养步骤四所获乳酸菌pSEC-MP:GFP，获得培养物，再用质量浓度为1ng/ml的乳链菌肽Nisin诱导培养物，诱导时间为3h，即完成乳酸菌基因工程菌的构建。

进一步地限定，步骤二所述GFP基因的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地限定，步骤四所述PCR鉴定的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。