[发明专利]数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法

说明书

本发明提供了数字PCR定量检测PML‑RARA融合基因的试剂盒及方法，具体地本发明开发了一种基于数字PCR平台，定量检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)中PML‑RARA融合基因长型(L型、bcr1)和短型(S型、bcr3)mRNA的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，实验结果表明本发明的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一种特殊类型的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)，占同期AML的10％-15％，发病率约0.23/10万。APL临床表现凶险，起病及诱导治疗中易发生出血和栓塞而引起死亡。近三十年来，由于全反式维甲酸(ATRA)及砷剂的规范化临床应用，APL已成为基本不用进行造血干细胞移植即可治愈的白血病。

目前，APL的病因尚不明确，但随着分子生物学、细胞遗传学等学科的快速发展，人们对APL的分子生物学发病机制有了较深的了解。98％以上的APL患者具有特异性染色体易位t(15；17)(q22；q21)，易位的结果导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)和17号染色体上的视黄酸受体α(RARα)形成PML-RARA融合基因，其蛋白产物导致细胞分化阻滞和凋亡不足，是APL发生的主要分子机制。

由于PML基因的断裂点不同，产生不同长度的PML-RARA融合基因转录本，最终可产生3种不同的PML-RARA融合基因的异构体，分别为长型(L型，bcr1)，变异型(V型，bcr2)和短型(S型，bcr3)，其中长型的发生率约占55％，短型约占45％，变异型约占5％。通过检测PML-RARA融合基因是诊断APL的最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后和复发预测最可靠的指标。

目前PML-RARA融合基因常用的检测包括荧光原位杂交(FISH)、免疫分型、实时定量PCR技术(RQ-PCR)和数字PCR等检测方法。

(1)荧光原位杂交(FISH检测)，利用携带荧光标记的核酸探针与被检样本中的靶核酸序列进行杂交，在荧光显微镜下直接分析杂交靶序列的彩色探针信号，从而获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。虽然通过FISH法可根据染色体易位断裂点设计的特异性探针，特异性较好，灵敏度较高，但由于FISH检测的实验操作复杂，对操作人员要求较高，且仅能进行定性检测。

(2)免疫分型技术常采用流式细胞仪(FCM)对特异抗原进行检测，利用荧光素标记单克隆抗体(McAb)作为分子探针，多参数分析白血病细胞的胞膜和胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被检测白血病细胞所属细胞学系及分化程度。采用FCM检测微量残留白血病，依赖于肿瘤细胞异常的免疫表型，包括表达交叉系列抗原、抗原表达不同步、抗原表达水平改变等，虽然可对白血病进行定量监测，但因在治疗过程中，白血病细胞免疫表型会产生变化，常需采用两个免疫表型对患者微量残留白血病。FCM法需要特殊仪器，操作技术要求较高，价格昂贵，检测结果重复性不佳。

(3)实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR)，基于Taqman探针荧光定量PCR，Taqman探针5’端标记一个荧光分子，3’端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)。PCR扩增时，由于Taq酶5’→3’外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。该方法操作相对较为简单，但定量检测时依赖于标准曲线，定量准确性差，灵敏度不佳。