[发明专利]肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

权利要求书

1.肝癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括SCN4B、HOXA10、BDH1中的一种或多种。

2.肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：

1)SCN4B甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合2或引物探针组合3，其中所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物、如SEQ ID NO.6所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物、如SEQ ID NO.9所示的荧光探针；

2)HOXA10甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4或引物探针组合6，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物、如SEQ ID NO.12所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物、如SEQ ID NO.18所示的荧光探针；

3)BDH1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合8或引物探针组合9，其中所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物、如SEQ ID NO.24所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQ ID NO.25所示的上游引物、如SEQ ID NO.26所示的下游引物、如SEQ ID NO.27所示的的荧光探针。

3.如权利要求2所述的用于肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，还包括括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.30所示的荧光探针。

4.如权利要求2或权利要求3所述的用于肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。

5.如权利要求2或权利要求3所述的用于肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。

6.一种肝癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的PCR引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。

7.如权利要求6所述的肝癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述肝癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μM PCR引物、0.1-1μM探针。

8.如权利要求6所述的肝癌基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的数字PCR反应条件如下：

9.肝癌基因甲基化检测的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分离待测生物样品中目标基因的核酸；

2)将步骤1)所得核酸经亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的DNA，即Bis-DNA；

3)采用甲基化数字PCR技术检测步骤2)所得Bis-DNA的甲基化状态。

10.如权利要求1所述的肝癌基因甲基化检测位点、如权利要求2所述的肝癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合、如权利要求6所述的肝癌基因甲基化检测试剂盒或如权利要求9所述的肝癌基因甲基化检测的检测方法在制备检测肝癌试剂盒中的应用。