[发明专利]肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

说明书

本发明提供肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测肝癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合数字PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选肝癌高甲基化候选基因，针对肝癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现肝癌的早期筛查与诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及肝癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用。

背景技术

肝癌是我国一种常见的恶性肿瘤疾病之一，死亡率位居恶性肿瘤第二位。好发于中年男性，肝癌早期一般没有症状或者症状不典型，可能会有食欲减退、腹胀、呕吐等非特异性消化道症状，当患者感受到明显不适或临床症状非常明显的时候，病情大多进入中晚期，而晚期肝癌治疗并不理想，生存时间往往只有半年到一年半。因此建立肝癌预警和早期筛查的方法，对肝癌的防治非常重要，早发现、早诊断、早治疗、早手术是防控肝癌的有效手段。

目前肝癌的诊断技术有：1)甲胎蛋白检测：一般在原发性肝癌当中表现出升高的比较多，但肝炎病变或者其他的肿瘤也有可能导致升高，特异性不高；2)影像学技术：MRI检查、B超检查、CT检查，但对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；3)肝穿刺活检：在超声或CT引导下的肝穿刺活检是目前确诊肝癌最可靠的方法，但该方法属于有创性检查，还存在一定的假阴性率，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发灵敏、特异的新型肝癌标识物和检测技术，提高肝癌早癌检出率、改善肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率。

表观遗传学是指基因的核苷酸序列不发生改变而基因表达发生了可遗传的变化，是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明肝癌与其他多种癌症一样，是由多种致癌因素长期作用的结果，其病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。

DNA甲基化的检测方法大致可分两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量筛选发现目标基因的手段。特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐且易造成样本污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，甲基化荧光定量法基于其较高的通量和敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用较为广泛，但基于荧光定量PCR的甲基化荧光定量法需要额外制备标准曲线才能对样本核酸定量，同时在检测低浓度的核酸样本时灵敏度不足，容易造成假阴性从而延误癌症的早诊早治时机，给DNA甲基化的检测带来了技术挑战。与荧光定量PCR相比，数字PCR具有更高的检测灵敏度和准确性，数字PCR方法通过将核酸样本稀释，遵循泊松分布规律，将其分配至微反应单元中，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号进行统计学分析，彻底摆脱对标准曲线的依赖而直接给出靶序列的拷贝数，提高了实验结果在批内和批间的稳定性，实现对起始样品的绝对定量，同时提高核酸检测方法的灵敏度，有效减少假阴性的出现。