[发明专利]用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括如下成分：低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、抗生素、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸和甲状腺原氨酸。

2.根据权利要求1所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基，其特征在于：低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基与DMEM/F12培养基的体积比为1:1，低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基与DMEM/F12培养基的体积之和占所述椎间盘间充质干细胞的培养基总体积的百分比为89％。

3.根据权利要求1所述的用于分离提起人的椎间盘间充质干细胞的培养基，其特征在于：添加胎牛血清的体积百分比为6％、抗生素体积百分比为1％、重组成纤维生长因子浓度为2-10ng/ml、表皮生长因子浓度为2-10ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。

4.根据权利要求1所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述抗生素为青霉素和链霉素的混合物。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基的制备方法，其特征在于：在445ml低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基中加入50ml胎牛血清、抗生素青霉素和链霉素5ml、重组人成纤维生长因子2.5ug、表皮生长因子2.5ug、胰岛素5mg、乙酰半胱氨酸2.5ml、甲状腺原氨酸5ug，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。

6.一种利用如权利要求1-5任一项所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基进行椎间盘间充质干细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S110：将无菌条件下获取的人椎间盘组织剪碎后用冰磷酸盐缓冲液PBS混合后离心；

步骤S120：加入用I型和II胶原酶混合物消化、离心；

步骤S130：使用用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基重悬单个细胞后水浴；

步骤S140：再次用用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基重悬、过滤后移入培养瓶中；

步骤S150：连续培养5-7天后，干细胞成克隆生长后，用普通培养基可传代持续培养。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤S110中，用4℃的冰磷酸盐缓冲液混合切碎的椎间盘组织后低速离心。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤S120中，使用混合的I型和II型胶原酶消化，I型和II型胶原酶质量比为1:1。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：混和胶原酶和磷酸盐缓冲液的总体积分数比为1:1000，每克椎间盘组织使用1ml胶原酶-磷酸盐缓冲液消化，振荡水浴消化时间为0.5-2小时，消化时水浴温度为37℃。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤S130中，消化后的单细胞用用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基重悬，放入37℃水浴中静置15分钟。