[发明专利]用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法

说明书

本发明提供了一种用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域，培养基包括如下成分：低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、抗生素、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸和甲状腺原氨酸。本发明提出的提取方法和提取专用培养基能在较小损伤干细胞的情况下，快速获得大量人的椎间盘干细胞。所提取的原代脂肪干细胞在传代前的活力较强，干细胞纯度高。经过传代以后，该椎间盘干细胞依然具有较高的增殖和分化能力。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法。

背景技术

随着生活方式的改变，久坐或强迫体位造成的椎间盘突出已经成为一个在世界范围内影响人类健康的重要问题。而椎间盘突出易导致神经系统、心血管系统等一系列疾病的并发。已有许多研究证实，椎间盘突出可以引起感觉异常、脑供血障碍，甚至引起高位截瘫或马尾神经症状等。目前，这种由椎间盘突出而导致的多种疾病在世界范围内的广泛流行使得人们越来越关注其相关的机制研究。因而，阐明椎间盘细胞的发生过程，揭示椎间盘细胞分化及调控中的细胞分子水平的机理，可以为椎间盘细胞退化所引起的相关疾病的预防和治疗提供坚实的理论基础，特别是针对上述疾病进行细胞分子水平的药物筛选，具有重要的现实意义。

作为再生医学和组织工程领域的研究热点之一，椎间盘组织再生技术是重建和修复由老化和病理因素等导致的椎间盘组织丢失和损伤的重要技术手段。而间充质干细胞作为椎间盘再生工程的种子细胞来源，可大大地驱动新生组织的重建。

当前已有的基于脐带、骨髓等间充质干细胞提取方法，并不能很好的提供和椎间盘相同或相近的间充质细胞来源，并且效率低下，同时还需要几周的时间来获得成熟的定向分化细胞，不仅仅是诱导周期长，还在一定程度上增加了成本花费。因此，传统的技术手段一定程度上削弱了其在临床治疗和组织工程中的应用价值。

研究表明，椎间盘干细胞易于获取，是非常有前途的细胞治疗椎间盘退化用细胞来源。然而，目前的培养体系，不能保证其高效的扩增，因而降低了其大规模基础、临床试验以及临床应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于分离提取人的椎间盘干细胞的培养基、制备方法及椎间盘干细胞的培养方法，以解决上述背景技术中存在的至少一项技术问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一方面，本发明提供一种用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基，包括如下成分：低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、抗生素、重组成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、乙酰半胱氨酸和甲状腺原氨酸。

优选的，低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基与DMEM/F12培养基的体积比为1:1，低糖达尔伯克氏改良伊格尔DMEM培养基与DMEM/F12培养基的体积之和占所述椎间盘间充质干细胞的培养基总体积的百分比为89％。

优选的，添加胎牛血清的体积百分比为6％、抗生素体积百分比为1％、重组成纤维生长因子浓度为2-10ng/ml、表皮生长因子浓度为2-10ng/ml、胰岛素浓度为10ug/ml、乙酰半胱氨酸浓度为2mM、甲状腺原氨酸浓度为10ng/ml。

优选的，所述抗生素为青霉素和链霉素的混合物。

第二方面，本发明提供一种如商所述的用于分离提取人的椎间盘间充质干细胞的培养基的制备方法，在445ml低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基中加入50ml胎牛血清、抗生素青霉素和链霉素5ml、重组人成纤维生长因子2.5ug、表皮生长因子2.5ug、胰岛素5mg、乙酰半胱氨酸2.5ml、甲状腺原氨酸5ug，0.22μm滤器过滤除菌，4℃储存备用。