[发明专利]用于进行核酸多重检测的方法

权利要求书

1.用于检测样品中的靶核酸的方法，其包括以下步骤：

(a)提供以下反应组分：

(i)针对每一种所述需要定量测定的靶核酸序列，提供一种上游引物和一种检测探针；其中，所述上游引物包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述检测探针包含与所述靶核酸序列互补的序列，并且标记有定量报告基团和淬灭基团；并且，当与所述第一靶核酸序列杂交时，所述上游引物位于所述检测探针的上游；并且，所有检测探针所标记的定量报告基团彼此不同；

(ii)针对每一种所述需要定性测定的靶核酸序列，提供一种上游引物和一种媒介子探针；其中，所述上游引物包含与所述靶核苷酸序列互补的序列；所述媒介子探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶特异性序列，所述媒介子序列包含不与所述靶核酸序列互补的序列，并且，所述靶特异性序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；并且，当与所述靶核酸序列杂交时，所述上游引物位于所述靶特异性序列的上游；并且，所有媒介子探针所包含的媒介子序列彼此不同；

(iii)针对(ii)中所述的媒介子探针提供一种或多种通用探针，其中，每一种通用探针各自独立地从3'至5'方向包含：与一种或多种媒介子序列或其部分互补的一种或多种捕获序列，以及模板序列；并且，所述一种或多种通用探针所包含的捕获序列能够分别与(ii)中所述的每种媒介子探针的媒介子序列或其部分互补；并且，每一种通用探针各自独立地标记有定性报告基团和淬灭基团；

(b)使含有待测靶核酸序列的样品在单个反应容器中与(a)中所述的组分接触，并实施PCR反应条件；

(c)在PCR循环中的特定温度下测量来自(a)(i)中所述的定量报告基团的信号，所述特定温度高于退火温度和延伸温度；基于所测定的所述定量报告基团的信号，确定对应靶核酸序列的存在或其量；

(d)在PCR结束后，对扩增产物进行熔解曲线分析，所述熔解曲线分析包括测量来自(a)(iii)中所述的定性报告基团的信号，基于所测定的所述定性报告基团的信号，确定对应靶核酸序列的存在。

2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中所述的特定温度高于退火温度和延伸温度至少10℃，至少15℃，或至少20℃；

优选地，步骤(c)中所述的特定温度为变性温度；

优选地，所述变性温度为94–98℃。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(b)中所述的PCR反应条件包括使用具有5'核酸酶活性的核酸聚合酶；

优选地，所述核酸聚合酶具有如5'外切核酸酶活性；

优选地，所述核酸聚合酶是DNA聚合酶；

优选地，所述核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。

4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中，(i)中所述的检测探针中的定量报告基团为荧光基团(例如ALEX-350,FAM,VIC,TET,CAL Gold 540,JOE,HEX,CAL Fluor Orange 560,TAMRA,CAL Fluor Red 590,ROX,CAL Fluor Red 610,TEXAS RED,CAL Fluor Red 635,Quasar 670,CY3,CY5,CY5.5,Quasar 705)，所述淬灭基团为能够吸收/淬灭所述荧光的分子或基团(例如DABCYL、BHQ(例如BHQ-1或者BHQ-2)、ECLIPSE、和/或TAMRA)；

优选地，(i)中所述的检测探针是自淬灭探针；

优选地，(i)中所述的检测探针在其5'末端或上游标记有定量报告基团且在其3'末端或下游标记有淬灭基团，或者在其3'末端或下游标记定量报告基团且在5'末端或上游标记淬灭基团；优选地，所述定量报告基团和淬灭基团相距10-80nt或更长的距离；

优选地，(i)中所述的检测探针是线性的，或者具有发夹结构；

优选地，(i)中所述的检测探针可以被酶(例如DNA聚合酶)降解。