[发明专利]用于进行核酸多重检测的方法

说明书

本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地，本申请提供了一种检测靶核酸序列的方法，所述方法能够在单一反应体系中同时定性和定量检测多种靶核酸序列，并且具有高通量、低成本、探针选择灵活、高灵敏和高特异的特点。

技术领域

本申请涉及核酸分子的多重检测。特别地，本申请提供了一种检测靶核酸序列的方法，所述方法能够在单一反应体系中同时定性和定量检测多种靶核酸序列。

背景技术

20世纪末发展起来的实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性好且操作简便等优点。实时PCR是检测核酸的一种常用工具，作为一种闭管检测模式，操作简便，扩增产物污染机会低，应用广泛。近些年在此基础上发展起来的多重实时荧光定量PCR，它把多种病原体检测集中到一管中进行反应，既节省了成本，又兼具了荧光定量PCR的准确性和灵敏度。但此种模式能检测的最大靶序列数目受限于实时PCR仪器的荧光检测通道数，因此很多研究或专利虽然通过利用多重定量检测体系来减少成本，但一个反应管中检测对象的数量依旧较少。

PCR核酸检测的另一种检测模式是扩增后的熔解曲线分析，此种模式是在扩增后增加一个变温过程，可检测的最大靶序列数目等于在荧光检测通道数目的基础上增加了探针与靶序列之间的熔点这个维度，相对于实时检测模式大大提高，检测对象也有所增多。Faltin等Clinical Chemistry 2012,58(11):1546-1556描述了一种“媒介子探针PCR”的实时PCR检测模式——此种模式我们称之为单探针检测系统，该模式使用了一种双探针检测系统——即一个靶序列需要两个探针——它包括一个非荧光标记的靶序列特异的媒介子探针和另一个不与靶序列结合的荧光标记探针。然而，Faltin等人的方法也存在着明显的缺陷。特别地，当将Faltin等人的方法用于进行需要区分每一个靶序列的多重实时PCR时，针对每一个靶序列都需要设计一个携带靶特异性序列的媒介子探针和一个对应的、带有独特荧光信号的荧光探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时PCR相比，Faltin等人的方法需要使用双倍数目的探针。相应地，整个反应体系变得更为复杂，检测成本也变得更高。但李庆阁等曾利用此原理发明了一种同时检测多种靶核酸序列在样品中的存在方法，在CN108823287B专利中提供了一种探针组，设计了不同荧光标记的“检测探针”，每一个检测探针又对应较多媒介子，大大提升了检测通量，由于非荧光标记的媒介子探针成本低廉，荧光探针又可作为通用探针适用于不同靶序列，因此，与检测不同靶序列的单重实时PCR体系相比，可以公用一种通用的荧光探针，从而降低成本。此方法应用到了多方面的检测，比如，但此方法存在的缺点是无法对检测对象进行定量分析。

而在核酸检测的很多方面，只通过定性分析或者只通过定量分析无法满足需求，比如病原体检测方面，存在致病菌和定植菌，这种情况下需要区分定植与感染。在转基因检测方面，对于不同的转基因产品检测标记基因，有的只需要定性检测即可，有的需要进行定量检测。对于建立多重核酸检测的反应，单纯依靠媒介探针无法满足对需定量核酸的检测，如果全部用线性探针反应成本更高。

开发一种在单一反应管同时定性定量检测多靶标的方法是十分必要的。关于同时定性定量检测方面，CN102559868B公开了一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法，其是在目标对象基因序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物，在引物扩增产物中选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异探针，每组的探针配备相同的荧光基团作为一个检测通道，通过熔点曲线分析分辨靶序列。这种方法需要调整每条探针的熔点，在探针设计上存在一定难度，且每组探针均需要添加荧光基团，相对于媒介探针成本较高。因此，仍然需要进行靶核酸的高通量多重检测的准确方法。

因此，依然需要开发新的进行靶核酸多重检测的方法，以便能够以更简单的反应体系、更低的检测成本来实现高通量、高灵敏和高特异的靶核酸检测。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。