[发明专利]一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法在审
| 申请号： | 202011498184.0 | 申请日： | 2020-12-17 |
| 公开（公告）号： | CN112410448A | 公开（公告）日： | 2021-02-26 |
| 发明（设计）人： | 许萍萍;李彬;杨静;钱茱希;刘晓宇;周密密;何丹军;吴翠萍 | 申请（专利权）人： | 中华人民共和国金陵海关 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/04;C12N15/11 |
| 代理公司： | 南京汇盛专利商标事务所(普通合伙) 32238 | 代理人： | 袁静 |
| 地址： | 210000 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 丁香 假单胞菌 豌豆 致病 变种 微滴式 数字 pcr 分子 检测 方法 | ||
1.用于丁香假单胞菌豌豆致病变种的组合物，其特征在于包括组合物1和组合物2，所述组合物1含有引物A1F、A1R和探针AP1，所述组合物2含有引物B3F、B3R和探针BP3；所述引物A1F、A1R的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，TaqMan探针AP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，TaqMan探针AP1的5’端结合有荧光发光基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA；引物B3F、B3R的序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，TaqMan探针BP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，TaqMan探针BP3的5’端结合有荧光发光基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA。
2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于丁香假单胞菌豌豆致病变种包括I群和II群。
3.一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，其特征包含如下步骤：
(1)将豌豆样品采用生理盐水浸泡过夜，离心取沉淀，提取基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，采用引物B3F、B3R和探针BP3进行微滴式数字PCR检测；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则进行步骤(3)；
(3)以所述基因组DNA为模板，采用引物A1F、A1R和探针AP1进行微滴式数字PCR检测；若阳性微滴数大于0，则待测样品中含有丁香假单胞菌豌豆致病变种；若阳性微滴数小于或等于0，则样品中无丁香假单胞菌豌豆致病变种。
4.根据权利要求3所述丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，其特征在于微滴式数字PCR检测中的反应体系包括：10μL的ddPCR supermix(2×)、0.4μL的上游引物、0.4μL的下游引物、0.2μL的TaqMan探针、2μL基因组DNA和7μL的ddH2O。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征在于微滴式数字PCR检测中的反应条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，60度退火及延伸60s，共40个循环；98℃固化微滴10min。
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