[发明专利]一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法

说明书

本发明提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，属于生物技术领域。该检测方法使用引物A1F、A1R和探针AP1，引物B3F、B3R和探针BP3。引物A1F、A1R的序列如SEQ ID NO:1‑2所示，TaqMan探针AP1的序列如SEQ ID NO:3所示，引物B3F、B3R的序列如SEQ ID NO:4‑5所示，TaqMan探针BP3的序列如SEQ ID NO:6所示，AP1和BP3的5’端均结合有荧光发光基团FAM，3’端均结合有荧光猝灭基团TAMRA。本发明检测方法，可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法。

背景技术

豌豆细菌性疫病的病原菌为丁香假单胞菌豌豆致病变种(Pseudomonas syringaepv.pisi)，属于薄壁菌门(Gracilicutes)假单胞菌科(Pseudomonadaceae)假单胞菌属(Pseudomonas)丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的致病变种，革兰氏阴性菌。该病菌主要寄主为豌豆(Pisum sativum)，自然条件下也可侵染扁豆(Lablab purpureus)、山黧豆(Lathyrus odoratus)、宽叶山黧豆(L.latifolius)、野豌豆属(Vicia spp.)和孟加拉野豌豆(V.benghalensis)。该病菌可引起寄主植物花梗、花和豆荚等萎蔫枯死，导致植株猝倒，早期侵染可造成严重损失，对产量影响较大。

豌豆细菌性疫病为我国禁止进境植物检疫性细菌病害，1915年首次报道在美国科罗拉多州发生,随后该病害迅速扩散至世界各豌豆重要生产区，我国尚无分布。

豌豆细菌性疫病菌主要随种子进行远距离传播，病菌在种子表面或种子内部可存活数个生长季节，经表面药剂处理后的种子内部仍有病菌存活，因此极难防治。

豌豆是我国第一大食用豆进口品种，中国是全球第二大进口国，加拿大、美国是我国的豌豆主要进口国。豌豆细菌性疫病在加拿大广泛分布，美国的加利福利亚州、科罗拉多州、堪萨斯州、纽约州、华盛顿州、威斯康辛州均有分布。海关从加拿大进口豌豆中多次检出过该病菌，因此，该病菌随进口豌豆等大宗农产品传入、定殖和扩散的可能性都很大，并可随种子的调运在国内传播。因此，豌豆细菌性疫病病原菌已成为我国豌豆生产潜在的巨大威胁。

丁香假单胞菌P.syringae寄主范围广，常见的致病变种已达60多种，种内致病变种的区分和鉴定一直是植物病原细菌鉴定中的难点。因寄主范围相近，在对进口豌豆疫情检测中，丁香假单胞菌豌豆致病变种与丁香致病变种、菜豆变种、大豆变种常常并存，难以区分。同时，丁香假单胞菌豌豆致病变种根据8个不同豌豆栽培种无毒基因(A)与抗性基因(R)的相互作用被分为8个生理小种。根据病原菌特异性片段，并以此设计引物进行PCR扩增，8个生理小种分别扩增出272bp或132bp片段，因此将8个生理小种分为两个系统发育群，I群为1、3B、4B、5、7生理小种，II群为2、3A、4A、6、8生理小种。从现有研究资料来看，II群相对来说更常见。对致病变种的鉴定，采用生理生化方法耗费时间较长，同时一些理化鉴定结果易于因为主观上的差异从而不能客观反应不同致病变种之间的差异。近些年，在分子生物学检测方法上，进行了较多的尝试，但存在特异性不足、耗时较长等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种丁香假单胞菌豌豆致病变种微滴式数字PCR分子检测方法，可快速、灵敏、准确、高特异性地对口岸进口的豌豆种子进行丁香假单胞菌豌豆致病变种的检测。

本发明的目的采用如下技术方案实现：