[发明专利]多重荧光PCR法技术筛查嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的方法、引物及探针和组合物

说明书

本发明涉及多重荧光PCR技术对嗜酸性粒细胞增多相关融合基因进行筛查的方法、引物及探针和组合物，筛查的嗜酸性粒细胞增多相关融合基因包括：FIP1L1‑PDGFRa、ETV6‑PDGFRβ、ETV6‑ABL、PCM1‑JAK2、BCR‑FGFR1、ZNF198‑FGFR1共6种。本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，将嗜酸性粒细胞增多相关融合基因整合在一起进行筛查，能更全面地辅助骨髓增殖性疾病的诊断、治疗及预后监测，本发明经济、准确度高、特异性强，适于大批量样本的临床检测。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种采用多重荧光PCR技术对嗜酸性粒细胞增多相关融合基因进行筛查的方法、引物及探针和组合物。本发明筛查的嗜酸性粒细胞增多相关融合基因包括：FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ、ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1。

技术背景

嗜酸性粒细胞是人体重要的一种细胞，约占白细胞总数的0.5％到3.0％临床上多见的是嗜酸性粒细胞增多的情况，诱发原因较多，因人而异。嗜酸性粒细胞增多症(hypereosinophilic syndrome，HES)是骨髓增殖性疾病的变异型，以嗜酸性粒细胞增多伴靶器官损害为特征。表现为不明原因的血液和/或骨髓嗜酸性粒细胞(eosinopilcell，EC)持续性增多。2008年修订的世界卫生组织(WHO)淋巴和造血组织肿瘤分类新增了“伴嗜酸粒细胞增多和PDGFRa，PDGFRβ或FGFRl异常的髓系和淋系肿瘤”这一组疾病类型。2016年修订的WHO指南提出了伴有PDGFRA、PDGFRB、或FGFR1重排或PCM1-JAK2和嗜酸性粒细胞增多的髓系/淋系肿瘤各亚型诊断标准，需要对相关的融合基因进行分子分析。

del(4)(q12)导致形成FIP1L1-PDGFRα融合基因，5'端为FIP1L1基因的部分结构，断裂点一般位于第7～10内含子附近大约40kb的区域，3'端为PDGFR基因的部分结构，断裂点一般在第12内含子附近。t(5；12)(q31-33；p12)染色体易位导致形成ETV6-PDGFRβ融合基因。PDGFRβ断裂点一般位于10号外显子上游区域。目前发现至少14个fgfr1伙伴基因，最常见的是位于13q12上的znf198基因，目前通过NCBI共检索到30余例伴有t(8；13)(p11；q12)遗传学异常的病例报道，但大部分患者未进行分子学检测。

对于上述这些融合基因，断裂位点多且不确定，同时发现有大量的伴侣基因。染色体核型分析可以检测染色体异常，不能确定核型变化形成的是哪种融合基因。FISH方法存在特异性的问题，且费用较高。高通量测序可以明确未知易位位点的检测手段，单费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广。荧光PCR法可以针对已知的融合位点设计特异性的引物组合，使用全血样本提取出的RNA逆转录之后通过多重荧光PCR进行定性分析，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。

发明内容

鉴于目前嗜酸性粒细胞增多相关融合基因筛查不能满足经济便利、检测范围广和结果准确等要求。本发明设计出一套用于多重荧光PCR方法的引物和探针对嗜酸性粒细胞增多相关融合基因进行筛查。其优点在于经济、准确度高和特异性强。

一种使用多重荧光PCR技术筛查FIP1L1-PDGFRa、ETV6-PDGFRβ,ETV6-ABL、PCM1-JAK2、BCR-FGFR1、ZNF198-FGFR1这6种常见嗜酸性粒细胞增多相关融合基因的核苷酸序列如下(5’to3’)：

FIP1L1-9F：GCAGAGATCCAAGATGGCAGAT

FIP1L1-10F：TTGTTCAAGACTGGGCTTCCA

FIP1L1-11F：ATATGGGAGGGCCGAATCA

FIP1L1-12F：GGGCAAATGAGAACAGCAACA