[发明专利]反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法

权利要求书

1.一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法，包括如下步骤：

采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；

根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度；

所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：

液相条件为：

色谱柱为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；

流动相A：体积比为1000：1的水与甲酸的混合液；

流动相B：体积比为1000：1的乙腈与甲酸的混合液；

梯度洗脱的程序如下：

0～1min，流动相A的体积分数为99％；

1～8min，流动相A的体积分数由99％下降至90％；

8～9min，流动相A的体积分数保持为90％；

9.01～10min，流动相A的体积分数由90％上升至99％；

流速为0.2mL/min；

柱温为30℃；

进样量为5μL；

所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：

质谱条件为：

采用正离子监测模式进行检测，其中，酪氨酸的参数为：母离子的m/z为182.2，子离子的m/z为165.2，碎裂电压为75V，碰撞能为6eV；苯丙氨酸的参数为：母离子的m/z为166，子离子的m/z为120.1，碎裂电压为95V，碰撞能为15eV；赖氨酸的参数为：母离子的m/z为147.2，子离子的m/z为84.1，碎裂电压为80V，碰撞能为16eV；亮氨酸的参数为：母离子的m/z为132.2，子离子的m/z为86.1，碎裂电压为55V，碰撞能为9eV；缬氨酸的参数为：母离子的m/z为118.2，子离子的m/z为72.1，碎裂电压为44V，碰撞能为5eV；丙氨酸的参数为：母离子的m/z为90.1，子离子的m/z为44.1，碎裂电压为22V，碰撞能为15eV；甘氨酸的参数为：母离子的m/z为76.1，子离子的m/z为30.2，碎裂电压为80V，碰撞能为8eV；

所述提取的步骤如下：

向所述蚯蚓样品中加入水后依次经涡旋和超声，然后加入蛋白酶XIV，再次涡旋后于室温下黑暗振荡；然后置于55～65℃的热水浴中进行超声辅助提取。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述水的添加量为45～55ml/g蚯蚓样品。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：加入所述蛋白酶XIV前，所述涡旋的时间为30～60s，所述超声的时间为5～15min。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：加入所述蛋白酶XIV后，所述涡旋的时间为0.5～1.5min，所述振荡的时间为18～32h。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：所述超声辅助提取的时间为1～2h。