[发明专利]反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法

说明书

本发明公开了一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。本发明与以往检测氨基酸的方法相比，减少了繁琐的衍生化过程，并且前处理较为简单，直接用水提取即可，避免使用有机有毒试剂，对研究者而言是一种更加有益健康的方法，还能为生物毒理学研究提供可靠的理论支撑。

技术领域

本发明涉及一种反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法。

背景技术

七种氨基酸(亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)除了合成多肽和蛋白质外，还参与一些特殊的代谢反应，而代谢过程可以直接反映生物体在当前所处的生理环境的变化情况。这7种代谢物的变化主要影响机体的三羧酸循环过程。三羧酸循环是三大营养素(氨基酸、糖类和脂类)的最终代谢途径，又是这三种主要代谢相互联系的枢纽。这些代谢物的显著变化严重影响了三羧酸循环过程，导致机体的各代谢之间的不协调，从而影响机体的正常生命活动。

目前，大量的代谢组学研究都采用核磁共振光谱对代谢物进行检测和分析，但是由于核磁共振低灵敏度的局限性与生物样品的复杂性导致核磁共振光谱检测较为有限。而高效液相色谱串联电喷雾三重四极杆质谱(HPLC-ESI-MS)因其灵敏度和限行范围方面具有的优势被大量使用测定代谢物。联用技术的使用为生物代谢物来了极大的方便。如中国专利申请(公开号CN111638293A)公开了一种采用LC-MS/MS同时检测动物组织中的氨基酸和核苷酸的检测方法。该方法采用LC-MS/MS同时检测动物组织中的氨基酸和核苷酸，采用超高效液相色谱-静电离子轨道肼质谱系统可以同时采用正负离子模式检测氨基酸和核苷酸，这对与质谱仪器的要求较高，仪器使用费用消耗非常大，并且仪器价格昂贵，使用的几率较低。如中国专利申请(公开号为CN111307975A)公开了一种采用HPLC-FLD分离测定小鼠皮层中8中氨基酸的检测方法。该方法中需采用衍生化试剂进行衍生化反应之后，检测化合物的不同吸光度，从而获得化合物含量，增加了检测的复杂性，衍生化试剂的配制与进行衍生化反应，可以引入实验的系统误差，导致结果的误差值变大。在检测中，要求实验的系统误差尽可能的小，以确保实验结果的准确度高。因此有必要对现有检测方法进行改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用反相高效液相色谱串联质谱检测蚯蚓体内氨基酸的方法，省去繁琐的衍生化过程，避免其他离子的干扰，可以在短时间内实现多种代谢物的同时检测，为生物代谢物大量同时检测提供理论依据。

本发明所提供的反相高效液相色谱串联质谱法检测蚯蚓体内七种氨基酸的检测方法，包括如下步骤：

采用水提取蚯蚓样品，离心后取上清夜，经稀释后进行反相高效液相色谱串联质谱检测，得到待测蚯蚓样品中亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的峰面积；

根据每种氨基酸的峰面积与浓度之间的标准曲线，即得到蚯蚓样品中各氨基酸的浓度。

上述的检测方法中，所述反相高效液相色谱串联质谱检测的条件如下：

液相条件为：

色谱柱为：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱；

流动相A：体积比为1000：1的水与甲酸的混合液；

流动相B：体积比为1000：1的乙腈与甲酸的混合液；

梯度洗脱的程序如下：

0～1min，流动相A的体积分数为99％；

1～8min，流动相A的体积分数由99％下降至90％；