[发明专利]一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法

说明书

本发明公开了一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括如下步骤：(1)外植体灭菌处理；(2)初代培养基筛选；(3)下胚轴愈伤组织诱导；(4)下胚轴愈伤组织增殖培养；(5)下胚轴愈伤组织芽分化；(6)生根培养；(7)组培苗移栽；本发明以优质青海大黄种子为外植体，通过灭菌处理、初代培养、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖培养、愈伤组织芽分化、生根培养和组培苗移栽，使得下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，本发明能够缩短繁殖周期，提高繁殖效率，可为后续转基因与遗传改良研究提供理论基础与技术支持，另外，还可为以后对青海大黄系统研究、种苗商业化生产及药用价值挖掘提供依据。

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法。

背景技术

大黄(Rheum palmatum L.)是蓼科大黄属的多年生草本植物，是我国传统的中草药，具有极高的药用价值。大黄干燥根和根茎，性味苦、寒，药效广泛，《中国药典》2015年版描述其功效“泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄”。古代，大黄常以贴膏外用或水煎液内服，当今，大黄方剂在治疗儿科、外科、妇科等临床常见病以及急、危、重症及疑难病方面都具有显著功效，主要包括大便秘结、胃肠积滞、湿热泻痢、目赤、痈肿疔疮、水火烫伤、活血化淤、湿热黄疸、急性胰腺炎等。

青海大黄是唐古特大黄的优质变种，由于其生长在海拔高的青海、西藏地区，地域局限性大，加之传统播种繁殖方式具有周期长、繁殖系数低等局限性。近年来，随着青海大黄需求量的日益增长，传统的播种育苗手段已不能满足市场的需求。因此，急需开发一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法以解决上述技术问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，以优质青海大黄种子为外植体，通过灭菌处理、初代培养、愈伤组织诱导、愈伤组织增殖培养、愈伤组织芽分化、生根培养和组培苗移栽，采用不同激素培养基配比，使得青海大黄下胚轴愈伤组织诱导率可达90％，愈伤组织增殖系数可达4.3，组培苗移栽成活率可达95％，通过对青海大黄组培快繁体系的建立，能够缩短繁殖周期，提高繁殖效率，可用于青海大黄的商业化生产，更好地发挥其药用价值，同时也为后续青海大黄系统研究及遗传改良工作提供了基础。

为了实现上述目的，本发明提供的一种青海大黄下胚轴组培与快繁方法，包括以下步骤：

(1)外植体灭菌处理：选取饱满的青海大黄种子作为外植体，先采用蒸馏水浸泡3h，并在操作台剥壳去翅，用无菌滤纸滤干后置于50ml离心管内，用75％乙醇充分浸泡20s，用ddH₂O(double distilled H₂O)冲洗3次，再用2％NaClO(次氯酸钠)消毒液浸泡20min，用ddH₂O反复冲洗4～5次，再置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中滤干种子表面水分，待用；

(2)初代培养基筛选：将步骤(1)的待用无菌外植体接种到初代培养基中，种子胚轴朝下，1/3种子浸没在培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，光照培养16h/d，暗培养8h/d，光强阈值为4800～6000lx，培养30d后萌发生长成苗；

(3)下胚轴愈伤组织诱导：将步骤(2)获得的无菌苗放入无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干表面水分，使用无菌手术刀切分，取下胚轴接种到诱导培养基中，光照培养箱温度为20±1℃，暗培养7d，光照培养8d，光强阈值为4800～60001x，培养15d后诱导出愈伤组织；

(4)下胚轴愈伤组织增殖培养：将步骤(3)诱导出的下胚轴愈伤组织移栽到增殖培养基中培养20d；

(5)下胚轴愈伤组织芽分化：将步骤(4)的下胚轴愈伤组织移栽到芽分化培养基中，培养15d后诱导出芽；