[发明专利]用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法

权利要求书

1.一种荧光探针的制备方法，包括：

S1：按质量比为1：1.8～2.2取4-羟基-苯并[b]噻吩-7-羧醛、乙基苯并吲哚加入到体积比为7：2～4的正丁醇/甲苯的混合溶液搅拌溶解，加热回流反应3～4h；

S2：反应结束后除去溶剂，在水和二氯甲烷的混合体系中静置分层，有机相进一步纯化，得到的荧光化合物Cy5-M；

S3：将得到的Cy5-M溶解在吡啶中，然后将三氯氧磷滴加到混合溶液中，室温下搅拌反应0.5～1h后，加入水继续搅拌反应0.5～1h；

S4：反应结束后除去溶剂，在二氯甲烷和水的混合液中进行萃取，保留水相，减压浓缩、纯化即得荧光探针CyP。

2.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中Cy5-M与三氯氧磷的固液比为1.6～1.8mg：1μL。

3.根据权利要求1所述的一种荧光探针的制备方法，其特征在于：所述荧光探针的合成路线为：

4.权利要求1所述的荧光探针在检测环境中碱性磷酸酶活性中的用途。

5.用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，包括：

S1：将权利要求1所述的荧光探针与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在含有MgCl₂的Tris-HCl buffer溶液中混合孵育，进行荧光光谱测试；

S2：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；

S3：将荧光探针和待测碱性磷酸酶溶液在含有MgCl₂的Tris-HCl buffer溶液混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶溶液的荧光光谱强度；

S4：利用步骤S2的标准曲线及步骤S3测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶活性。

6.根据权利要求5所述的用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于：所述步骤S1中碱性磷酸酶标准溶液的活性为0～300U/L。

7.根据权利要求5所述的用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于：所述步骤S1中荧光探针的浓度为18～23μM。

8.根据权利要求5所述的用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于：所述步骤S1中Tris-HCl buffer溶液的浓度为45～55mM，pH为7.5～8.5；所述MgCl₂的浓度为0.5～1.5mM。

9.根据权利要求5所述的用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于：所述步骤S1和S3中孵育温度为35～40℃时间为10～30min。

10.根据权利要求5所述的用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，其特征在于：所述荧光检测方法用于研究重金属污染下的海水中金属离子对ALP活性的影响。