[发明专利]用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法

说明书

本发明公开了用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，涉及化学分析检测技术领域。该检测方法具体为：将权荧光探针与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育，进行荧光光谱测试；利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；将荧光探针和待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶溶液的荧光光谱强度；利用标准曲线及测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶活性。本发明的荧光检测方法能够对碱性磷酸酶活性进行定量检测，检出限为0.093U/L，具有灵敏度高，抗干扰能力强，线性关系优异等优点。且可用于海洋环境中碱性磷酸酶活性的检测。

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法。

背景技术

磷酸盐被认为是藻类和细菌最重要的磷的来源，海水中的磷的缺乏会限制藻类的生长，限制海域的初级生产力，进而影响整个生态循环系统。早有研究表明，当海水缺乏无机磷时，水体中溶解有机磷(DOP)化合物可以作为磷营养源被藻类和细菌所利用，这便是海水中ALP的贡献。碱性磷酸酶(ALP)是一种胞外酶，能够利用磷酸单脂转变为所需的无机磷源(Pi)，在维持海洋生态方面有着重要的作用。在过去几十年中，诸如重金属等污染物的人为输入到海洋环境中，已在很大程度上增加了重金属浓度。这些污染物危害是持久的，不受细菌的分解，并且对海洋中各类动植物、微生物造成有害影响。对于生物体而言，当重金属的累积超过生物体的耐受性时，受污染的生物表现出新陈代谢的改变、生长缓慢、生物量减少等现象。对于海水来讲，当重金属离子超过一定范围，其对整个海域的初级生产力都会造成破坏。因此，开发设计高选择性碱性磷酸酶荧光探针，并将其用于研究金属离子胁迫下的海水ALP活性，这可以为研究重金属污染对海洋生态环境的影响提供新的途径。

最近，各种检测ALP检测手段已经被开发，包括电化学、色谱、比色技术及肽微阵列分析等等。虽然这些为ALP检测提供了有效的方法，但是对于底物，并没有良好的专一性，其中，有一个不可忽视的威胁来自于磷酸单酯酶中的酸性磷酸酶，这是由于碱性磷酸酶和酸性磷酸酶是一类对底物没有专一性水解功能的酶类，他们有着不同的最适pH值，分别为5和8左右，在传统的荧光和紫外吸收检测ALP的方法中，包括p-硝基苯磷酸二钠以及商化探针4-MUP，ELF-97等，是将样品溶解在Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.0)，在保证ALP的最大活力的同时，降低了ACP的活力，因此避免了ACP的干扰。但是，这类方法对于分析在真正环境下的ALP活性是有弊端的，这是由于很大程度上，环境中的碱性磷酸酶并不会存在于pH＝8.0的稳定的环境中。为此，设计一种能够适应不同环境下，单一检测ALP的探针对于精准定量是极为必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于环境的碱性磷酸酶活性的荧光检测方法，该荧光检测方法可定量检测ALP活性，具有较宽的线性检测范围和较低的检出限，且能够通过pH值来专一响应ALP而不受ACP的干扰。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种述荧光探针的制备方法，包括：

S1：取4-羟基-苯并[b]噻吩-7-羧醛、乙基苯并吲哚加入到正丁醇/甲苯的混合溶液搅拌溶解，加热回流反应；

S2：反应结束后除去溶剂，在水和二氯甲烷的混合体系中静置分层，有机相进一步纯化，得到的荧光化合物Cy5-M；

S3：将得到的Cy5-M溶解在吡啶中，然后将三氯氧磷滴加到混合溶液中，室温下搅拌反应0.5～1h后，加入水继续搅拌反应0.5～1h；