[发明专利]一种丁酸梭菌的培养方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌的培养方法，所述培养方法，包括制备丁酸梭菌菌悬液、一级种子液制备、二级种子液制备及发酵接种等步骤。本发发明使用优化的种子培养基与发酵培养基，提高了丁酸梭菌发酵过程中的种子质量与发酵质量，降低了发酵成本，该培养方法能够显著提高丁酸梭菌的产酸量，并显著提高其维生素K2含量，以获得稳定的工业化生产工艺。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌的培养方法。

背景技术

丁酸梭菌，又名酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸菌，主要分布在人的粪便和土壤中，其厌氧培养的过滤物中含有较少的脂肪酸，具有极强的整肠作用，它可抑制肠道中的致病菌，促进肠道中双歧杆菌和乳杆菌的生长。丁酸梭菌在动物肠道内除了促进动物肠道有益菌群的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生，还能在动物肠道内能产生B族维生素、维生素K、淀粉酶等物质，具有保健作用。丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质，不受胃酸、胆汁酸等影响，对多种饲用抗生素有较强的耐受性，能够作为新饲料添加剂的使用。维生素K2(VK2)在食品中含量极少,有“铀金维生素”之称,可以预防和治疗骨质疏松。

目前培养丁酸梭菌的方法普遍存在丁酸梭菌菌活数不高，菌体生物产量偏低，且大多为提高丁酸梭菌的产酸量，对提高丁酸梭菌的维生素K2含量现有报道，且目前培养丁酸梭菌的方法普遍存在不耐储藏、稳定性差，生产成本高等问题。专利文献CN110846258A公开了一种丁酸梭菌的高密度发酵生产方法，该方法采用优化的种子培养基与发酵培养基，简单的发酵过程控制，确定了丁酸梭菌工业化规模生产工艺，提高了丁酸梭菌发酵过程中的种子质量与发酵质量，但其发酵产物中合成维生素B和K含量偏低。专利文献CN107828688B公开了一株耐丁酸、抗逆性强的丁酸梭菌及其应用，虽然提高了丁酸梭菌发酵水平，但是其采用的是诱变技术对丁酸梭菌菌株进行筛选，成本较高，方法复杂，其产生维生素K的含量较低。

因此，迫切需要一种新的方法来实现丁酸梭菌的规模化生产。

发明内容

本发明旨在提供一种丁酸梭菌的培养方法，该培养方法能够显著提高丁酸梭菌的产酸量，并显著提高其维生素K2含量，降低成本，并显著增加动物小肠蠕动的速度，改善肠道消化功能，促进对饲料中各种营养成分的消化与吸收。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种丁酸梭菌的培养方法，包括以下步骤：

S1、制备丁酸梭菌菌悬液：吸取丁酸梭菌菌液，接种于RCM培养基中厌氧培养12-48h，然后1000-3000转离心2-5分钟，去除上层培养液保留沉淀，加入无菌生理盐水清洗沉淀，离心2-5分钟，重复清洗1-3次后，加入无菌生理盐水，与沉淀混匀，制成丁酸梭菌菌悬液；

S2、一级种子液制备：将步骤S1得到的丁酸梭菌菌悬液，接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0～7.0时，得到一级种子培养液；

S3、二级种子液制备：将步骤S2得到的一级种子培养液，接种于种子培养基中，进行密封厌氧培养12-18h，调节至pH值至6.0～7.0时，接种时往种子培养基中添加罗格列酮0.005-0.05g，发酵完成后，过滤得到二级种子培养液；

S4、发酵培养：将步骤S3得到的二级种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐内，密封厌氧培养，调节至pH值至5.0-6.0。

优选的，所述种子培养基为，1L培养基由以下组分组成：葡萄糖5.0～15.0g，酵母粉5.0～15.0g，蛋白胨5.0-15.0g，磷酸氢二钾0.25～0.75g，七水合硫酸镁0.2～0.6g，硫酸锰0.05～0.2g，氯化钙0.5～1.5g，硫酸亚铁2.0～7.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.7g，丁酸钠0.1-0.05g，余量为无菌水，pH6.0～7.0，115℃，灭菌30min，即得。