[发明专利]一种胶体金间接标记、封闭的方法

说明书

本发明涉及生物分析检测技术领域，尤其涉及一种胶体金间接标记、封闭的方法。该方法利用大分子封闭剂封闭后再利用小分子封闭剂封闭，使得胶体金表面的蛋白偶联物稳定性得到明显增强，利用该蛋白偶联物进行免疫检测可以有效提高偶联效率、敏感性、稳定性。

技术领域

本发明涉及生物分析检测技术领域，尤其涉及一种胶体金间接标记、封闭的方法。

背景技术

胶体金标记实质上是蛋白质等高分子直接被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是蛋白质等大分子经过一种或多种作用力和胶体金相互作用，形成相对稳定的复合物，这种作用力是静电作用、疏水作用、金-巯基共价结合等。胶体金和大分子物质相互作用后，通常会用非目标蛋白例如BSA进行封闭，封闭后由于位阻作用，在胶体金的表面有很多空白的位点，这些空白位点会吸附蛋白以及特定的小分子物质，和已吸附的目标蛋白竞争，造成目标蛋白脱落，稳定性不好。利用胶体金和目标蛋白的复合物制备成胶体金产品，具有方便、快速、无需仪器等优点，在生物检测领域得到了广泛的应用。

申请号为201110044743.5的中国专利“一种胶体金标记方法”描述了通过改变标记缓冲液pH的办法将蛋白直接标记在胶体金颗粒上，提升了稳定性和灵敏度。申请号为201310485455.2的中国专利“一种用于快速检测的胶体金共价标记方法”描述的是将蛋白经过处理引入更多的巯基，经过金-巯基形成共价键，从而将蛋白共价偶联在金颗粒表面。这2个专利，胶体金偶联蛋白质的方法有一个共性就是通过目标蛋白和胶体金颗粒直接接触吸附到胶体金颗粒表面，这种结合是无规则的吸附过程，蛋白和胶体金的空间距离非常小，并且非常容易在无规则吸附过程中屏蔽反应位点，造成标记蛋白反应性降低、标记效率不高。

申请号为201810498754.2的中国专利“一种胶体金利用标记羊抗鼠二抗后间接连接鼠抗标记的金标免疫层析试纸条的制备方法”描述了利用二抗和单抗在胶体金表面间接偶联的方法。申请号为201811168958.6的中国专利“间接标记纳米颗粒的抗体检测捕获法及其试剂盒”描述了利用标签抗体在胶体金表面进行吸附，之后再进行标签蛋白偶联。上述两个专利是在胶体金表面间接的标记蛋白，二者的共性是在胶体金表面间接的偶联蛋白提升了反应性和特异性，同时在进行第一阶段偶联是非特异的物理吸附，第二阶段是利用特异性反应间接的偶联目标蛋白，第一步吸附后由于在胶体金的表面有很多空白的位点，这些位点会吸附非标记物质，和已吸附的目标蛋白竞争，造成目标蛋白脱落，稳定性不好。

申请号为202010403046.3的中国专利“特异性抗体的检测标记物、其制备方法、其应用及试剂盒”描述了使用胶体金偶联大分子后甘氨酸作为封闭剂使用。申请号为201210027887.4的中国专利“免疫胶体金试纸及其配合光电传感器定量检测CLB的方法”描述了使用脱脂奶粉和甘氨酸的混合物作为封闭剂使用。这些封闭剂的封闭效果均不理想，导致免疫检测的偶联效率低、稳定性差的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种胶体金间接标记、封闭的方法。该方法利用大分子封闭剂封闭后再利用小分子封闭剂的封闭方法结合胶体金间接标记，使得胶体金表面的蛋白偶联物稳定性得到明显增强，利用该蛋白偶联物进行免疫检测可以有效提高偶联效率、敏感性、稳定性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种胶体金间接标记、封闭的方法，包括：

步骤1：获得包被有第一偶联物的胶体金颗粒，然后加入第一封闭液封闭，得复合物1；

步骤2：向胶体金-第一偶联物-第一封闭剂复合物中加入第二封闭液封闭，得复合物2；

步骤3：向复合物2中加入第二偶联物，获得胶体金蛋白偶联物；

所述第一封闭剂液由第一封闭剂和缓冲液组成，所述第一封闭剂选自BSA、Casein、孔蓝蛋白、高PEG20000、PEG6000的一种或多种；