[发明专利]一种RNA聚合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种RNA聚合酶突变体，其为细菌RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸突变所形成的突变体，其能够促进外源重组蛋白在需钠弧菌中的表达水平，从而增加重组蛋白质生产量，具有商业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNA聚合酶突变体及其在促进外源重组蛋白质表达中的用途。

背景技术

高效的微生物重组蛋白表达系统能够降低重组蛋白的生产成本。需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种革兰氏阴性、对人类非致病的海洋细菌。其倍增周期在7～10分钟之间，传代速度比大肠杆菌快一倍，是已知代时最短的自由生活细菌，或可发展为一个特色表达系统。研究发现，需钠弧菌单个细胞核糖体数量高达115000个，而大肠杆菌只有约70000～90000个，这意味着需钠弧菌具有更快的生物量合成速度和更强的蛋白表达能力。需钠弧菌的高生长和高底物摄取速率在作为宿主表达外源蛋白时，有望在前期快速生长，缩短发酵延滞期，在工业生产中节约能量和时间成本，具有经济意义。

pET系统被广泛用来表达外源重组蛋白质，构建时一般将目标蛋白基因置于T7启动子下游，而T7启动子只能由T7RNA聚合酶起始转录。T7RNA聚合酶具备高催化活力，它的转录速度比大肠杆菌内源的RNA聚合酶的转录速度快约8倍。当T7RNA聚合酶被充分诱导时，能够利用细胞中的大部分材料来起始目的蛋白的转录，且在数小时后，目标蛋白能够超过细胞总蛋白的50％。

蛋白质的表达有复杂性，不容易理性设计。当缺乏足够的理论知识和经验来改造具有更高性能的蛋白质生产菌株时，可以使用进化方法分离这样的变异菌株，即通过选择或筛选具有更优生产特性的遗传突变株。通过该策略可以获得一些与外源蛋白质高表达相关的突变位点，用于构建下一代蛋白表达底盘细胞。因此，挖掘与新型表达宿主需钠弧菌蛋白质高表达相关的新靶点可以帮助科研人员优化需钠弧菌蛋白质表达系统。

然而，到目前为止，尚没有研究报道使用筛选方法分离出需钠弧菌蛋白质高产突变株、以及提高pET系统蛋白质表达的有效突变。

发明内容

考虑到需钠弧菌是目前生长最快的自由生活菌，有望成为下一代细胞工厂用于蛋白质高效表达，通过诱变和高通量筛选技术，或许能够强化T7RNA聚合酶的表达，这对于增加外源重组蛋白(甚至包括外源毒性蛋白)表达是有利的。出于该目的，发明人通过对需钠弧菌VnDX进行紫外诱变和流式细胞分选技术，发现几株对外源蛋白表达水平提高的突变菌株基因组中RNA聚合酶β’亚基发生了突变，在获得的诱变菌株中导入某些蛋白质的pET表达质粒后，发现重组菌株生产这些蛋白质的能力更强，获得了更高的充足蛋白质产量。这一发现构成了本发明的基础，具体而言，本发明包括如下技术方案：

一种RNA聚合酶突变体，其为细菌RNA聚合酶β’亚基rpoC发生第457位酪氨酸(Y或Tyr)突变所形成的突变体。所述的突变选自酪氨酸(Y)被其他氨基酸替换、缺失、或者化学修饰。优选是降低rpoC活性的突变体，即rpoC发生负向突变。

在一种实施方式中，上述酪氨酸(Y)突变是指酪氨酸(Y)突变为其他氨基酸(X)，该情况下该突变体可简称为rpoCY457X，所述其他氨基酸(X)选自下组：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)，从而使RNA聚合酶β’亚基rpoC成为RNA聚合酶β’亚基rpoC突变体。

优选地，上述酪氨酸(Y)突变是酪氨酸(Y)突变为选自下组的氨基酸：组氨酸(H或His)、亮氨酸(L或Leu)、缬氨酸(V或Val)、丙氨酸(A或Ala)、甲硫氨酸(M或Met)、半胱氨酸(C或Cys)或者丝氨酸(S或Ser)。

其中，RNA聚合酶β’亚基rpoC的氨基酸序列为SEQ ID NO:1：