[发明专利]一种在活体细胞上实时检测消皮素D的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种在活体细胞上实时检测消皮素D的方法及其应用，属于医学检测技术领域。本发明通过构建含有双荧光标签标记的GSDMD过表达质粒，将两种不同颜色的荧光蛋白序列分别设置于GSDMD的N端和C端序列外侧，再通过转染将过表达质粒直接转染到目的细胞；通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜实时动态观察荧光变化，反映GSDMD的活化及时空定位变化；从而提供了一种能够在活体细胞上进行实时检测GSDMD的表达、切割、活化和定位，同时又能够兼顾检测过程的简洁高效以及检测费用的相对低廉的方法，对于免疫炎症相关的研究具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种在活体细胞上实时检测消皮素D的方法及其应用，属于医学检测技术领域。

背景技术

炎症细胞死亡的失调是许多炎症性疾病的关键因素。焦亡是细胞死亡的一种高度炎性形式，它利用细胞内产生的孔洞破坏电解质稳态并执行细胞死亡。细胞焦亡是许多疾病恶化到一定程度的表现。消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)是焦亡的成孔效应蛋白，它协调膜裂解和高炎症分子的释放，如白介素-1(IL-1)，增强了先天免疫反应的过度激活。然而，迄今为止，还没有破坏焦亡的药理学机制。

研究表明GSDMD被切割后，其氨基端(N端)片段可以定位至细胞膜表面并形成孔道，改变细胞膜通透性，从而使细胞内外物质可以自由通过，此时细胞外水可自由进入细胞，导致细胞膨胀和破裂，最终引起细胞死亡，这一现象称之为细胞焦亡。因此，GSDMD是细胞焦亡的最终效应分子。此外，还有研究表明，GSDMD的N端片段(GSDMD-N)可以定位于线粒体膜，并形成孔道，改变线粒体膜通透性，从而使线粒体与细胞浆内环境相通，线粒体内有害物质，例如细胞色素C、线粒体DNA、活性氧类等可以由此孔道释放，造成细胞损伤。以上证据表明，GSDMD的表达、切割、活化、定位对细胞的功能和细胞命运有重要影响。但目前对GSDMD观察和检测的手段有限，对组织或细胞的GSDMD的表达主要依赖于蛋白免疫印迹法(Western blot)，若想进一步检测组织或细胞的GSDMD及其切割片段在线粒体或胞浆的表达，则需要将线粒体与胞浆成分分离后分别检测。此外，还可以利用免疫电镜技术观察组织或细胞的GSDMD及其切割片段在细胞及亚细胞结构(细胞器)的分布和定位。另外，通过免疫化学或免疫荧光染色法也可观察到甲醛或多聚甲醛固定后的组织或细胞内的GSDMD及其切割片段的表达和定位。但是，以上方法均无法在活体或活细胞上对GSDMD的表达、切割、活化、定位进行实时观察和检测；而且，以上方法均需要依赖于抗原-抗体反应，其方法的敏感性和特异性存在一定问题；此外，以上检测方法的在时间或费用上需投入较多，例如Western blot、免疫化学/荧光染色及线粒体蛋白的提取步骤多，过程较繁琐，购置相关抗体较为昂贵；电镜的样品制备及检测的准备过程较久、检测费用较高。因此，开发出一种能够在活体细胞上进行实时检测GSDMD的表达、切割、活化、定位，同时又能兼顾检测过程的简洁高效以及检测费用的相对低廉的方法对于免疫炎症相关的研究有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为解决如何能够在活体细胞上进行实时检测GSDMD的表达、切割、活化、定位，同时又能够兼顾检测过程的简洁高效以及检测费用相对低廉的技术问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种在活体细胞上实时检测消皮素D的方法；包括以下步骤：

步骤1：构建含有双荧光标签标记的GSDMD过表达质粒；

步骤2：用上述步骤1中获得的质粒进行细胞转染；对转染后的细胞进行药物干预诱导炎症小体活化及下游GSDMD切割；

步骤3：通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察细胞内荧光强弱和颜色的变化；

步骤4：通过线粒体荧光染色标记线粒体，通过荧光共定位观察GSDMD活性片段在线粒体上的定位情况。

优选地，上述步骤1中双荧光标签标记GSDMD设为两种不同颜色的荧光蛋白序列设于GSDMD的N端和C端序列外侧。