[发明专利]一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法在审
| 申请号： | 202011517907.7 | 申请日： | 2020-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN112609019A | 公开（公告）日： | 2021-04-06 |
| 发明（设计）人： | 叶昌荣;彭佩;李乐;唐顺学;肖金华;田冰川 | 申请（专利权）人： | 华智生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 长沙智路知识产权代理事务所(普通合伙) 43244 | 代理人： | 张毅 |
| 地址： | 410125 湖*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 转基因 基因 编辑 位点纯 合体 筛选 方法 | ||
1.一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法，其特征在于，对目标基因发生基因编辑的T1代个体，利用针对转基因载体设计的KASP标记引物进行高通量筛选，去除含有转基因成分的个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因编辑位点纯合的个体。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以基因编辑后T0代个体的DNA为模板，分别针对基因编辑载体的sgRNA插入片段和目标基因编辑的靶标位点进行扩增测序，筛选去除多个载体插入或基因编辑载体插入后靶标位点未被编辑的个体；
(2)以T1代个体的DNA为模板，先针对转基因成分进行KASP高通量筛选，去除转基因个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因被编辑且编辑位点纯合的个体。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，若步骤(2)未筛选到编辑位点纯合的个体，则选取编辑位点杂合的个体繁育后代，对T2代个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因被编辑且编辑位点纯合的个体。
4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，针对基因编辑过程中使用的载体序列的U6启动子和gRNA scaffold区段设计sgRNA标记引物。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，所述sgRNA标记引物序列如下：
sgPF：GAAGAGAAGCAGGCCCATTT；
sgPR：TGACCTGCAGGACTAGTGGA。
6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述KASP高通量筛选是针对基因编辑过程中使用的基因编辑载体的U6启动子序列设计KASP标记引物。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述KASP标记引物序列如下：
KfPU6-1F：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAGAGAAGCAGGCCCATTT；
KfPU6-1R：GCGATGTGGGACTTTTGAAG。
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