[发明专利]一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法

说明书

本发明涉及基因编辑技术领域，具体公开了一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法。有别于现有筛选方法的是，本发明所述筛选方法对目标基因发生基因编辑的T1代个体，利用针对转基因载体设计的KASP标记引物进行高通量筛选，去除含有转基因成分的个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因编辑位点纯合的个体。本发明可以应用于各种动植物基因编辑后代群体的高通量鉴定与筛选，特别是对大群体的编辑后代，比如构建基因编辑突变体库需要鉴定筛选数万至数十万个基因编辑个体，应用本发明的技术方案将显著提高筛选效率。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法。

背景技术

基因编辑技术包括ZFN、TANLEN、CRIPSR等技术。CRISPR技术因其方法简单、成本低等优点越来越成为主流技术，并被成功应用到动物、植物和微生物的不同种类的物种中。

基因编辑技术不仅可以突破传统育种难以解决的遗传障碍，而且能实现特定性状的精准改变，颠覆已有动物遗传改良技术路径和选育效率。伴随着基因编辑技术的不断改进及其在动植物上的广泛应用，世界各地的研究人员已对不同物种的植物和动物的基因组进行了大量编辑，创制了新的变异，推动了动植物育种的进程。通过基因编辑获得T0转化个体后，需要进行一系列的检测来筛选不含转基因成分的突变个体。目前的基因编辑样品检测，主要通过PCR扩增检测载体带入的转基因片段，并通过PCR扩增和测序检测插入sgRNA序列和对应的靶标编辑位点序列。PCR扩增产物测序可以用一代测序或二代测序完成，该体系中PCR扩增和一代测序均无法实现高通量检测，样品量大时建库是限制二代测序通量的瓶颈，而且建库费用较高。

因此，针对成千上万份的基因编辑材料的后代个体进行的筛选与检测，目前仍然是比较费工费时的，亟待开发一种低成本、高通量的筛选方法以弥补现有技术的不足。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法。

本发明的技术方案如下：一种无转基因的基因编辑位点纯合体的筛选方法，对目标基因发生基因编辑的T1代个体，利用针对转基因载体设计的KASP标记引物进行高通量筛选，去除含有转基因成分的个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序，筛选目标基因编辑位点纯合的个体。

进一步地，所述筛选方法包括如下步骤：

(1)以基因编辑后T0代个体的DNA为模板，分别针对基因编辑载体的sgRNA插入片段和目标基因编辑的靶标位点进行扩增测序，筛选去除多个载体插入或基因编辑载体插入后靶标位点未被编辑的个体；

(2)以T1代个体的DNA为模板，先针对转基因成分进行KASP高通量筛选，去除转基因个体，再对非转基因个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序(同T0代靶标基因引物)，筛选目标基因被编辑且编辑位点纯合的个体。

在实际应用中，若步骤(2)未筛选到编辑位点纯合的个体，则选取编辑位点杂合的个体繁育后代，对T2代个体进行基因编辑靶标区段的扩增测序(同T0代靶标基因引物)，筛选目标基因被编辑且编辑位点纯合的个体。

进一步地，步骤(1)中，针对基因编辑过程中使用的载体序列的U6启动子和gRNAscaffold区段设计sgRNA标记引物，对基因编辑载体的sgRNA插入片段进行扩增测序。

更为具体地，所述sgRNA标记引物序列如下：

sgPF：GAAGAGAAGCAGGCCCATTT；

sgPR：TGACCTGCAGGACTAGTGGA。

进一步地，步骤(2)中，针对基因编辑过程中使用的基因编辑载体的U6启动子序列设计KASP标记引物，对转基因成分进行高通量筛选。