[发明专利]TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，包括：

在非人动物细胞内导入人TNFRSF1B基因，使所述人TNFRSF1B基因在非人动物细胞中表达产生人源化的TNFRSF1B蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因的表达。

2.根据权利要求1所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，利用基因编辑技术对非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因进行改造，得到人源化TNFRSF1B基因；

优选地，所述非人动物为啮齿类动物；更优选地，所述啮齿类动物为小鼠；

优选地，所述细胞为受精卵细胞。

3.根据权利要求2所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人源化TNFRSF1B基因选自下列组中的至少一种：

(a)所述人源化TNFRSF1B基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：8所示；

(b)所述人源化TNFRSF1B基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示；

(c)所述人源化TNFRSF1B基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：10所示。

4.根据权利要求2所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现；所述构建方法具体包括：提供包括人TNFRSF1B基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。

5.根据权利要求4所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述非人动物为小鼠，所述人TNFRSF1B基因同源重组载体包括从5’端到3’端依次排列的5’同源臂、人TNFRSF1B基因、小鼠Tnfrsf1b基因、polyA以及3’同源臂。

6.根据权利要求5所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述人TNFRSF1B基因的序列包括人TNFRSF1B基因内含子1的部分序列与人TNFRSF1B基因的部分编码区序列，所述人TNFRSF1B基因内含子1的部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述人TNFRSF1B基因的部分编码区序列如SEQ ID NO：2所示；

优选地，所述小鼠Tnfrsf1b基因的序列如SEQ ID NO：3所示；

优选地，所述小鼠Tnfrsf1b基因与所述polyA之间还设置有WPRE调控元件，所述WPRE调控元件的序列如SEQ ID NO：4所示；

优选地，所述polyA的序列如SEQ ID NO：5所示；

优选地，所述5’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：10所示；

优选地，所述3’同源臂的DNA序列如SEQ ID NO：11所示。

7.根据权利要求5所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的靶位点序列如SEQ ID NO：20-29任一项所示；

优选地，所述sgRNA的靶位点序列如SEQ ID NO：29所示。

8.一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞，其特征在于，所述TNFRSF1B基因人源化动物细胞由权利要求1-7中任一项所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法获得。

9.一种TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，将如权利要求8所述的TNFRSF1B基因人源化动物细胞或者由所述TNFRSF1B基因人源化动物细胞发育得到的胚胎移植至代孕母体内进行发育，得到F0代动物；

对F0代动物进行检验，获得基因型鉴定正确的F0代阳性动物。

10.根据权利要求9所述的TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，还包括：将所述F0代阳性动物与野生型动物交配，扩大种群数量，同时杂合子动物与杂合子动物交配获得纯合子动物，建立稳定的TNFRSF1B基因人源化动物品系。