[发明专利]TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用

说明书

本申请提供一种TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用。本申请构建的人源化TNFRSF1B基因改造动物模型能够加速与人TNFRSF1B基因或蛋白相关的领域的研究进展，例如利用人源化TNFRSF1B基因改造动物模型代替人试药，为进行TNFRSF1B靶点药物的临床前实验提供有效的模型和有力的工具。

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法及应用。

背景技术

TNFRSF1B(TNF receptor superfamily member 1b)为TNF受体超家族成员，也称为TNFR2，表达仅限于抑制性免疫细胞，尤其是调节性T细胞(Tregs)、髓系抑制性细胞(MDSCs)、内皮细胞和生长过程中的选择神经元。其配体TNF主要识别TNFR1进行凋亡，依赖TNFRSF1B进行与T细胞存活相关的功能——通过激活NFκB诱导激酶(NIK)诱导NFκB的非规范性激活，从而促进Tregs细胞增殖和生存。许多实验表明TNFRSF1B拮抗型抗体可以抑制肿瘤细胞和Tregs的增殖，理论上可用于多种肿瘤的治疗；而激动型抗体可以促进Tregs增殖和活化，进而抑制效应T细胞(Teffs)，从而治疗自身免疫疾病，为免疫治疗提供了新的靶点。

目前，使用TNFRSF1B拮抗型抗体抑制Tregs，恢复肿瘤免疫应答并消除肿瘤，已经成为了肿瘤免疫治疗的有效策略。而人源TNFRSF1B靶点药物的筛选及临床前试验需要在动物模型上进行评价，但由于种属性的差异，人源TNFRSF1B与鼠源Tnfrsf1b蛋白的同源性只有62％，在小鼠上筛选的靶点药物并不完全适用于人类，同样针对人源TNFRSF1B蛋白的药物也不一定能够识别小鼠的Tnfrsf1b蛋白。因此，构建具有人源TNFRSF1B靶点的人源化小鼠模型，在筛选评价人源TNFRSF1B靶点药物中具有非常高的应用价值。

发明内容

本申请的目的在于提供一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法、TNFRSF1B基因人源化动物细胞、TNFRSF1B基因人源化动物模型的构建方法以及由该方法制得的TNFRSF1B基因人源化动物模型的应用、来源于人源化TNFRSF1B基因改造动物模型或其子代的细胞或细胞系或细胞培养物的组织或器官及其应用，以加速与人TNFRSF1B基因或蛋白相关的领域的研究进展。

为实现以上目的，本申请提供一种TNFRSF1B基因人源化动物细胞的构建方法，包括：

在非人动物细胞内导入人TNFRSF1B基因，使所述人TNFRSF1B基因在非人动物细胞中表达产生人源化的TNFRSF1B蛋白，同时降低或消除所述非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因的表达。

在一些实施例中，利用基因编辑技术对非人动物细胞内的内源TNFRSF1B基因进行改造，得到人源化TNFRSF1B基因；

优选地，所述非人动物为啮齿类动物；更优选地，所述啮齿类动物为小鼠；

优选地，所述细胞为受精卵细胞。

在一些实施例中，所述人源化TNFRSF1B基因选自下列组中的至少一种：

(a)所述人源化TNFRSF1B基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：8所示；

(b)所述人源化TNFRSF1B基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示；

(c)所述人源化TNFRSF1B基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO：10所示。

在一些实施例中，所述构建方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现；所述构建方法具体包括：提供人TNFRSF1B基因同源重组载体、sgRNA以及Cas9的混合物，所述Cas9包括Cas9 mRNA和/或Cas9蛋白，将所述混合物注射到所述非人动物细胞中，将所述非人动物细胞转移至培养液中进行培养。