[发明专利]一种抗叶霉病番茄材料的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种抗叶霉病番茄材料的制备方法，包括通过农杆菌浸染将叶霉病抗性基因Cf‑5转入番茄子叶外植体中，经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了叶霉病抗性植株。通过病原真菌接种试验抗性筛选，获得叶霉病抗性材料，以克服现有抗叶霉病番茄材料不足的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗叶霉病番茄材料的制备方法。

背景技术

番茄(Lycopersicon esculentum)是我国重要的蔬菜作物，在促进我国农村经济发展中发挥重要作用。番茄叶霉病（Fulvia fulva Ciferri）是番茄生产中的主要病害之一，一旦发病，即迅速蔓延，造成严重减产，最高可达80%。国内外在番茄抗叶霉病育种的研究上取得了一定进展，到目前已有许多抗病品种应用到生产实践中。由于番茄叶霉病病菌生理小种分化速度较快，以前抗叶霉病的品种有的已经表现为感病，在某些地区表现抗性，但在另一个地区抗性较差。防治叶霉病的最有效方法是培育抗病品种，亟需培育含有叶霉病抗性基因且具有持久抗性的番茄品种。培育抗病品种比较普遍的做法是采用常规育种导入抗性基因，再用相应的分子标记多次进行抗性基因鉴定、筛选。常规育种可控性差，选择优良品系的时间较长，通过分子技术手段的高科技育种目标性强，可有目的的进行抗性目的基因的筛选，育种进程快。本发明通过把叶霉病抗性基因Cf-5通过根瘤农杆菌介导转化到番茄中，进而筛选获得阳性过表达番茄株系，通过抗病性筛选获得抗病番茄材料，为进一步研究番茄抗病性和培育抗病番茄新品种奠定了重要基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗叶霉病番茄材料的制备方法，以克服现有抗叶霉病番茄材料不足的问题。本发明通过农杆菌介导法将含有叶霉病抗性基因Cf-5植物表达载体转入番茄子叶外植体中，经过共培养、卡那霉素筛选和分化再生,获得了叶霉病抗性植株。通过病原真菌接种试验抗性筛选，获得叶霉病抗性材料。

本发明是通过以下技术方案实现的:

一种用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物：

(+):cagtCGTCTCacaacatgatgatggttactagcaa (-):cagtCGTCTCatacactagaagcgattatttcttc。

本发明进一步公开了一种用于提高抗叶霉病番茄材料的基因Cf-5引物制备抗叶霉病番茄材料的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）通过番茄叶霉抗性目的基因Cf-5的保守DNA序列设计引物；

2）利用引物进行扩增，并纯化扩增产物；

3）将扩增后的产物与载体链接，得到含有目的基因的载体；

4)利用农杆菌侵染法将上述含有目的基因序列的载体转化到番茄中，以番茄子叶为外植体，通过愈伤组织诱导培养基诱导愈伤，愈伤组织转到分化培养基上诱导芽，待芽长至5厘米左右再转到生根培养基上生根。遗传转化卡那霉素抗性筛选，愈伤组织再生，获得遗传转化植株，并进行PCR验证；

5)利用室内离体叶片抗病性鉴定，筛选抗叶霉病植株，获得抗叶霉病新材料。

其中所述的遗传转化培养基指的是 ：

愈伤组织诱导培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.7mg/L+3%蔗糖；

分化培养基:MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+3%蔗糖；

生根培养基：1/2MS+IAA0.1mg/L+3%蔗糖。