[发明专利]一种基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物及其应用

权利要求书

1.一种基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物，其特征在于，所述RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’-TCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG-3’(SEQ ID NO .1)；

下游引物：5’-ATACAGGTGCAATTTCCGTCCGAAGGTTTG-3’(SEQ ID NO .2)；

所述上游引物的5’端采用FAM进行标记，所述下游引物的5’端采用生物素进行标记。

2.一种检测乙肝病毒的RPA试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物。

3.一种检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂，以及试纸条。

4.权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求所述的试剂盒在检测或辅助检测乙肝病毒中的应用；

或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测乙肝病毒的产品中的应用。

5.权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求3所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样品是否感染乙肝病毒中的应用；

或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求所3述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品是否感染乙肝病毒的产品中的应用；

或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2所述的RPA试剂或权利要求所3述的试剂盒在检测乙肝病毒中的应用；

或权利要求1所述的RPA引物或权利要求2或所述的RPA试剂或权利要求3所述的试剂盒在制备检测乙肝病毒的产品中的应用。

6.一种检测乙肝病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、用上述RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物； 步骤2、将步骤1中所得的RPA扩增产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析待测病毒是否为乙肝病毒，若试纸条上产生两条清晰条带，则所述待测病毒为或候选为乙肝病毒；若试纸条上仅产生一条质控条带，则所述待测病毒中不含有乙肝病毒。

7.根据权利要求6所述的检测乙肝病毒的方法，其特征在于：步骤1中所述RPA扩增的模板为待测病毒的DNA。

8.如权利要求6或7所述的检测乙肝病毒的方法，其特征在于，步骤1具体步骤如下：1）收集体液样本；2）利用酚氯仿法或Chelex100法，提取病毒DNA；3）应用RAP技术检测HBV特异序列：选取合适的片段设计RPA技术的上、下游引物；4）在ATP的参与下，重组酶uvsX与上游引物或下游引物相结合，形成重组酶引物复合体；复合体与基因模板上的引物同源靶序列相识别，RNA-DNA复合体解链，发生RNA聚合酶链置换反应，形成D形结构；5）单链结合蛋白Gp32与被置换的单链结合，防止单链被进一步替换；6）反应体系中加入核酸外切酶IV即nfo、nfo探针和反向引物；核酸外切酶IV识别并断开nfo的THF位点，启动延伸过程，形成FAM与生物素的双标记产物；7）重组酶uvsX离开引物3’端，链置换DNA聚合酶Bsu与引物的3’端结合启动链延伸形成互补链，最终形成完整的扩增子，形成的扩增子作为新的模板进行复制，实现目的片段的指数型扩增；8）在25℃-43℃的恒温条件下，10分钟内可有效扩增目的片段并进行检测判型。

9.根据权利要求6-8所述的任一检测乙肝病毒的方法，其特征在于，所述RPA扩增的温度为37℃ 。

10.权利要求6所述的检测乙肝病毒的方法在检测或辅助检测乙肝病毒中的应用。