[发明专利]一种基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于RPA‑LFD法检测乙肝病毒的RPA引物、胶体金侧流层析试纸条及其应用。所述基于RPA‑LFD法检测乙肝病毒的RPA引物由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，RPA试剂包括上述RPA引物；试纸条包括上述RPA引物或RPA试剂；应用于检测乙肝病毒的方法为先用上述RPA引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，然后将该产物滴加在试纸条加样区，根据试纸条上产生的条带情况分析是否为乙肝病毒。本发明针对乙肝病毒的DNA序列，设计特异性扩增引物，并基于该引物建立了乙肝病毒的RPA检测方法，可对乙肝病毒进行定性检测。基于该引物建立的乙肝病毒的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物及其应用，具体涉及基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物、胶体金侧流层析试纸条及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝脱氧核糖核酸(DNA)病毒组。是引起人类肝脏疾病的主要致病原之一。人体感染乙型肝炎病毒后，可引起细胞免疫及体液免疫应答，并激发自身免疫反应及免疫调节功能紊乱，致使病变的肝细胞产生或释放大量正常或异常的蛋白质，进一步促使免疫损害加重，使病情不断发展，严重危害人类健康。HBV感染是全球性的公共卫生问题，中国是HBV病毒感染大国，国家卫健委网站近日发布《2020年10月全国法定传染病疫情概况》，数据显示2020年10月(2020年10月1日0时至10月31日24时)，全国乙型肝炎病毒发病数为95633例，死亡33例，其准确的病原学诊断是治疗的关键。

目前，检测乙肝病毒的方法主要有：酶联免疫吸附法(ELISA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)、荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)等。国内外已有很多利用ELISA方法检测乙肝病毒的报道，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高灵敏度不及FQ-PCR。利用分子生物学技术开展病原学诊断是近年来新兴的检测技术手段，已建立的HBV病毒FQ-PCR探针杂交检测等方法，该技术从传统PCR技术发展而来，其基本原理相同，主要不同之处是在PCR反应体系中加入了有特定波长的荧光染料或荧光基团，借助荧光信号的积累来判断样品中特定核酸的情况。但该方法所需时间较长，费用较高，且对实验室设备环境要求高，不具备基层快速诊断的能力。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)是一种新型的恒温核酸扩增技术。其主要原理为模仿T4噬菌体内的核酸复制机制，依赖重组酶uvsX和单链结合蛋白Gp32在体外恒温条件下实现DNA模板的特异性识别与结合，并通过链置换DNA聚合酶Bsu实现模板DNA的扩增。该技术可在23-45℃下连续进行反应，反应时间只需5-20min，特异性强，灵敏度高，且无需相对严苛的实验室条件，其产品具备进行基层快速诊断的能力。配合发展较成熟的胶体金侧流层析法检测扩增产物，能有效规避现有检测技术的弊端，具有很大的推广前景。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物、胶体金侧流层析试纸条及其应用。本发明提供的基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器，适用范围广；基于该引物建立的乙肝病毒的RPA检测方法灵敏、准确、简便和快速，对临床相关疾病检验具有指导意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种基于RPA-LFD法检测乙肝病毒的RPA引物，该引物由SEQ ID NO.1所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.2所示的单链DNA分子组成，其核苷酸序列为：

上游引物：5’-TCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG-3’(SEQ ID NO.1)；